氯仿 1 毫升 蒸馏水 1000 毫升 氯仿（防腐） 2 — 3 毫升


用前稀释贮存液，再加 1.5％的蔗糖，pH5.8。如加 2％琼脂，即成基本固
体培养基。
　（2）补充培养基：在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、 核酸碱基、维生素等。氨基酸用量一般是 100 毫升基本培养基中加 5—10 毫 克。
　本实验所用的补充培养基只要在基本培养基中加适量的赖氨酸，赖氨酸缺 陷型菌株就能生长。
（3）完全培养基

基本培养基 1000 毫升 酵母膏 5 克 麦芽汁（亦可不加） 5 克 酶解酪素 1 克 维生素混合液 硫胺素 10 毫克 核黄素 5 毫克 吡哆醇 5 毫克 泛酸钙 50 毫克 对-氨基苯甲酸 5 毫克 10 毫升 菸酰胺 5 毫克 胆碱 100 毫克 肌醇 100 毫克 叶酸 1 毫克 蒸馏水 1000 毫克 蔗糖 20 克



（为获得大量分生孢子，可用 1％的甘油代替蔗糖。）
如加 2％琼脂，即为完全固体培养基。
　（4）麦芽汁培养基：可以代替完全培养基，配方简单。8 波美麦芽汁 2 份， 蒸馏水 1 份，再加 2％琼脂。
（5）马铃薯培养基：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，
取 200 克，加水 1000 毫升，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加
2％琼脂，20 克蔗糖，煮融，分装到试管中。也可将马铃薯切成黄豆大小的 碎块，每支试管放 3—4 粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖。 上述培养基都需分装到试管后，在 8 磅压力下消毒 30 分钟，取出斜摆， 成为斜面备用。
（6）杂交培养基：
KH2PO4 1.0 克
MgSO4 · 7H2O 0.5 克
KNO3 1.0 克
NaCl 0.1 克 CaCl2 · 2H2O 0.13 克
生物素 20 微克（或 5 毫克/100 毫升溶液 0.4 毫升） 微量元素溶液 1 毫升
（成分同基本培养基中微量素液配成 4 倍浓度的溶液稀释使用） 蒸馏水 1000 毫升
蔗糖 20 克
pH6.5
加 2 ％琼脂即成固体培养基。

（7）杂交培养基：

　将玉米在水中浸软，破碎，每试管放 2—3 粒，加入少量琼脂（0.1 克左右）， 再放入一小片经多次折叠的滤纸（长约 3—4 厘米），加上棉塞，消毒即成， 不需摆斜面。
3.药品：5％次氯酸钠（NaClO），5％石碳酸 五、实验步骤
　1.菌种活化：为使菌种生长得更好，先要进行菌种活化。把野生型和赖氨 酸缺陷型菌种从冰箱中取出，分别接在两支完全培养基试管斜面上，28℃温 箱培养 5 天左右。培养到菌丝的上部有分生孢子产生。
2.杂交：接种亲本菌株，可采用下述方法。
　（1）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生孢子或菌丝，25℃温箱 进行混合培养。注意要贴上标签，写明亲本菌株及杂交日期。在杂交后 5—7 天就能看到许多棕色的原子囊果出现，以后原子囊果变大变黑成子囊果，在
7—14 天左右，就可在显微镜下观察。
　（2）在杂交培养基上接种一个亲本菌株，25℃培养 5—7 天后即有原子囊 果出现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬浊于无菌水中（近于白色 的悬浊液），将此悬浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面基本湿润 即可（每支试管约加 0.5 毫升），继续在 25℃培养。原子囊果在加进分生孢
子 1 天后即可开始增大变黑成子囊果，7 天后即成熟。
3.显微镜观察：
　（1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角 瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。
（2）取一载玻片，滴 1—2 滴 5％次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放
在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在 5％次氯酸钠中洗涤， 再移到载玻片上），用另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显 微镜下（10×15 倍）检查，即可见到 30—40 个子囊。观察子囊中子囊孢子 的排列情况。这里用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，用 盖玻片压，盖玻片会破碎。也可在显微镜下用镊子把子囊果轻轻夹破，挤出 子囊。如发现 30—40 个子囊象一串香蔗一样，可加一滴水，用解剖针把子囊 拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻 片、用过的镊子和解剖针等物都需放入 5％的石碳酸中浸泡后取出洗净，以 防止污染实验室。
操作步骤见图 10-5。
4.实验步骤说明
　（1）实验所用的赖氨酸缺陷型，有时接种在完全培养基上，也长不好， 需要加适量赖氨酸。
（2）杂交后培养温度要控制在 25℃；30℃以上即抑制原子囊果的形成。 六、实验结果
　1.观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算 Lys 基因的着 丝粒距离。
　
子 囊 类 型 观 察 数 ＋＋＋＋————
————＋＋＋＋
＋＋——＋＋——
——＋＋——＋＋
＋＋————＋＋
——＋＋＋＋—— 合 计



2.绘一显微镜下观察到的杂交子囊的图。
　3.说明粗糙链孢霉中基因分离现象和高等动物、高等植物中基因分离的主 要区别。
4.用图表示第六种子囊类型的形成。
5.实验结果说明：
　（1）赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较迟，当野生型的子囊孢子已成熟而 呈黑色时，赖氨酸缺陷型的子囊孢子还呈灰色，因而我们能在显微镜下直接 观察不同的子囊类型。但是如果观察时间选择不当，就不能看到好的结果。 过早，所有子囊孢子都未成熟，全为灰色；过迟，赖氨酸缺陷型的子囊孢子 也成熟了，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。所以在子囊果形成期间， 要预先观察子囊孢子的成熟情况，选择适当时间进行显微镜观察。
（2）有时观察到的子囊孢子的排列为＋＋＋＋＋＋——，＋＋————
——，＋＋＋＋＋———，———＋＋＋＋＋，即为 6∶2 或 2∶6 的分离比
和 5∶3 或 3∶5 的分离比。排除上面第（1）点说明的原因外，这样的情况的 出现是由于基因转变造成的。基因转变的频率因基因位点不同而异，但一般
在 1％左右。
　（3）本实验用的赖氨酸缺陷型菌株为 Lys5，Lys5 基因座位于第六连锁群， 着丝粒距离约为 14.8 图距单位。可供实验结果计算时参考。
实验十一酵母菌杂交
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 酵母菌的生活史属于双单性类型，它们的单倍体细胞和二倍体细胞一般都 能进行无限制的分裂。以单倍体细胞为主的酵母菌称为单倍体酵母，例如粟 酒裂殖酵母（Schizosaccharamycespombe）。以二倍体细胞为主的酵母菌称 为二倍体酵母，如啤酒酵母（又称面包酵母，Saccharomycescerevisiae）。 这两种酵母常用作遗传学研究的材料，而啤酒酵母在酿酒工业和食品工业中 又有很大的应用价值。本实验用异宗配合型的啤酒酵母的单倍体菌株进行杂 交实验。任何一株酵母菌，如果使二倍体的营养细胞处于形成孢子的条件下， 都会发生减数分裂，生成四分体和子囊。每个子囊孢子具有四分子核，正常 情况下子囊中有 4 个子囊孢子，其中有 2 个 a 和 2 个α，a 和α表示两种相 对的接合型。具有这两种接合型的子囊孢子萌发生长成单倍体的菌株，不同 接合型的单倍体菌株细胞接合生成二倍体菌株。具有这样生活史的酵母菌称 为异宗配合型酵母。异宗配合型啤酒醇母的生活史见图 11－1。
　单倍体菌株分属 a 和α两种接合型，是受一对等位基因 a 和α控制的，这 对等位基因的座位在第三连锁群靠近着丝粒的地方。在光学显微镜下观察酵
　
母的染色体是十分困难的，但借助于电子显微镜，对酵母菌的细胞学已了解 得较多了。现已知啤酒酵母具有 17 个连锁群（n=17）。 两个属于不同接合型的营养缺陷型的酵母单倍体菌株，在基本培养基上都 不能形成菌落。当它们杂交形成二倍体杂种细胞，就能在基本培养基上生长。 二倍体杂种细胞在形成子囊孢子过程中，发生染色体重组，而使产生的子囊 孢子出现重组性状。
　　　　　　　　　　　　　　二、实验目的 通过酵母菌杂交实验了解异宗配合型啤酒酵母的生活史和基因自由组合 定律，掌握酵母菌杂交的基本方法。
三、实验材料
1.啤酒酵母单倍体腺嘌呤缺陷型（ade-），接合型为 a；
2.啤酒酵母单倍体组氨酸缺陷型（Hisl-），接合型为α。
四、实验器具和药品
　1.用具：试管，离心管，离心机，吸管，培养皿，三角烧瓶，涂布棒，石 英砂。
　2.药品：生理盐水（0.85 克 NaCl 溶于 100 毫升蒸馏水中，15 磅压力下消 毒 15 分钟），纤维素酶或蜗牛酶。
3.培养基：
（1）完全液体培养基：蛋白胨 2 克，酵母浸母汁 1 克，葡萄糖 2 克，水
100 毫升，pH6.0，8 磅压力下灭菌 30 分钟。
（2）完全固体培养基：在完全液体培养基中加 2％琼脂。
（3）基本液体培养基：葡萄糖 10 克，（NH4）2SO41 克，K2HPO40.125 克，
KH2PO40.875 克，KI*母液 1 毫升，MgSO4·7H2O0.5 克，CaCl2·2H2O0.1 克，
NaCl0.1 克，微量元素母液**1 毫升，维生素母液***1 毫升，水 1000 毫升，
pH5.3，8 磅压力下灭菌 30 分钟。
*KI 母液：10 毫克 KI 于 100 毫升水中。
**微量元素母液：H3PO41 毫克，ZnSO4·7H2O7 毫克，CuSO4·5H2O1 毫克，
CoCl2·6H2O5 毫克，水 100 毫升。
***维生素母液：烟碱酸 40 毫克，维生素 B140 毫克，肌醇 200 毫克，核
黄素 20 毫克，对-氨基苯甲酸 20 毫克，吡哆醇 40 毫克，泛酸 40 毫克，生物
素 0.2 毫克，水 100 毫升。
（4）基本固体培养基：在基本液体培养基中加 2％琼脂。
（5）产孢子培养基：CH3COONa8.2 克，KCl1.86 克，吡哆酵母液*1 毫升，
泛酸母液**1 毫升，生物素母液***1 毫升，琼脂 20 克，蒸馏水 1000 毫升。
*吡哆醇母液：20 毫克吡哆醇/100 毫升水。
**泛酸母液：20 毫克泛酸/100 毫升。
***生物素母液：2 毫克生物素/100 毫升。
（6）补充培养基：
a.基本固体培养基 100 毫升加组氨酸 3.5 毫克。
b.基本固体培养基 100 毫升加腺嘌呤 3 毫克。 五、实验步骤

　1.取盛有完全固体培养基斜面的试管 4 支。把 ade-和 Hisl-两菌种各接种 在二支斜面上。30℃温箱中培养 24 小时。
　2.用 5 毫升生理盐水洗下一支 ade-斜面上的菌，再倒入另一支 ade-试管 中，洗下的菌最后倒入无菌离心管中。另取 5 毫升生理盐水洗下 Hisl-二支 试管斜面的菌，倒入无菌离心管中。这样制成的菌液，浓度约 108/毫升。
3.两亲本菌液各吸 0.5 毫升，放入 5 毫升完全液体培养基中，30℃静止培
养 2 小时。
4.离心（3000 转/分，3 分钟），30℃静止培养半小时。
　5.倒去上清液，打匀管底菌块，再加入 6 毫升新鲜完全液体培养基，30℃ 培养过夜。
　6.离心，倒去上清液。再加 6 毫升新鲜完全液体培养基，洗一次，离心， 倒去上清液。
　7.将离心管中的沉淀菌接种在产孢子培养基斜面上，30℃培养 2—3 天。 在显微镜下观察杂交后形成的子囊，可见其中有 4 个子囊孢子。
8.测定子囊孢子的表型推断其基因型：
　（l）在长有子囊的斜面上加基本培养液 2 毫升，用接种环将子囊刮下， 倒入无菌离心管中。
（2）在 55°—60℃的恒温水浴中加热 15 分钟，杀死酵母菌的营养体，即
单倍体细胞。离心，倒去上清液，加生理盐水到原体积，形成子囊悬液。
　（3）把孢子悬液倒入消毒过的盛有石英砂的三角烧瓶中，振荡 5 分钟， 使子囊孢子散出，成为子囊孢子悬液。
（4）取打散的子囊孢子悬液 0.1 毫升涂布在完全培养基培养皿上，30℃
培养 48 小时。
　（5）影印培养：以上面的培养皿为原始培养皿，依次影印：a.基本培养 基；b.腺嘌呤补充培养基；c.组氨酸补充培养基；d.完全培养基。30℃培养
48 小时。
　（6）生长谱鉴定： a.从原始培养皿上挑取各个已经初步鉴定的菌落，接种在完全培养基斜面 上。同时接种在有 5ml 液体完全培养基的离心管中，30℃培养 48 小时。 b.离心（3000 转/分，3 分钟。），倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗 涤三次，最后加生理盐水至原体积。
C.吸取菌液 0.1 毫升，移至灭过菌的空培养皿中。然后倒入融化后冷至 40
°—50℃的固体基本培养基，摇匀，待凝。各做 1 皿。


　d.在每一培养皿的皿底划分四格，两格放少量组氨酸结晶粉末，另两格放 少量腺嘌呤的结晶粉末。然后放到 30℃温箱培养 48 小时。 e.观察生长情况，营养缺陷型菌株会在所需物质的周围长出来。如需要两 种物质，就只能在两种物质都扩散到的地方生长。
操作步骤见图 11-2。
9.实验步骤说明：
　（1）步骤 3—6，是为了用营养丰富的培养基培养好的新鲜细胞，并使不 同接合型的细胞充分接触，形成合子，为产生孢子创造条件。
（2）步骤 7 中，由于酵母在产孢子培养基上不会增殖，所以要求接种足

够多的细胞，使杂交形成的子囊不至于过少。
　（3）步骤 8（3），要从子囊中取得子囊孢子，也可用蜗牛酶充分处理子 囊后，用超声波处理使子囊孢子充分分散。蜗牛酶处理温度为 30°—37℃，
15—30 分钟。没有蜗牛酶，用石英砂振荡，也能使子囊壳破碎，散出子囊孢 子。
　（4）酵母菌是单细胞真菌，不形成菌丝，所以在步骤 8（5）中可采用影 印方法。
六、实验结果
　1.影印结果：能生长用“＋”表示，不能生长用“—”表示，并计算菌落 数。
基本培养基 腺嘌呤补充 培 养 基 组氨酸补充 培 养 基 完全培养基 单倍体基因型 生长情况 菌落数


2.生长谱鉴定：
皿号 添加 ade 添加 Hisl 单倍体的基因型 1
2
?
?



3.影印与生长谱鉴定结果相比较，看结论是否一致。
4.实验结果说明：
　本实验用的啤酒酵母营养缺陷型单倍体菌株，有关的 ade 和 Hisl 基因属 于不同的连锁群，是两对基因的自由组合。因此在实验结果中，单倍体基因 型的比例应为＋＋∶ade-∶Hisl-∶ade-Hisl-＝1∶1∶1∶1。单倍体菌株的
表型比也应为 1∶1∶1∶1。表型分离比直接反映了基因型的分离比。
实验十二大肠杆菌杂交
一、实验原理
　Lederberg 和 Tatum（1946）选用典型的大肠杆菌为材料，筛选营养缺陷 型。利用双重和三重缺陷型的菌株，在简单的合成培养基上混合培养，在此 培养基上只有重组子能长，亲本不能长，即所谓选择性培养，使细菌杂交获 得成功。图 12-1 说明了细菌的基因重组是不同基因型的细菌经接触，接合后 随之发生交换和杂种细菌分离的过程。


　大肠杆菌的杂交试验中发现有些菌株经混合培养能得到重组子，有些却不 能。1952 年 Hayes 做了一个实验，他所用的二个菌株是菌株 A 和菌株 B。菌
株 A 是不能合成甲硫氨酸和生物素；菌株 B 是苏氨酸、亮氨酸和维生素 B1
的三重缺陷型。Hayes 首先筛选链霉素抗性突变型 ASr 和 BSr，然后在不含链
霉素的基本培养基上进行正反杂交，结果没有不同，但在含链霉素的基本培

养基上进行正反杂交，结果却不一样，在 ASs×BSr 杂交中能得到重组子，可
是 ASr×BSs 杂交中却并不出现重组菌落。这一现象说明大肠杆菌中有不同的
“性”，它与致育因子 F 有关。同时按细胞中有无 F 因子将大肠杆菌分为二 类，有 F 因子的为 F+，没有 F 因子为 F-。F 因子是一个小的 DNA 环状分子， 分子量约 4.5×106 道尔顿。带有 F 因子的细胞，表面有一种称为性菌毛的毛 状突起，长约 1 至 20μ。性菌毛上有雄性专一噬菌体（MS2、k17、f2、Qβ 等）的吸附位点，又和细胞的接合有关。F 因子在细胞中能以二种状态存在； 游离状态和整合到寄主染色体的一定位置。以致带有 F 因子的大肠杆菌可分 为二类：F+和 Hfr 菌株。经吖啶橙处理 F+变为 F-，而 Hfr 性质不变，说明 F 因子在 F+菌株中呈游离状态，而在 Hfr 菌株中则整合到寄主染色体的一定位 置（图 12-2）。
大肠杆菌杂交在 F+与 F-菌株之间进行，通过细胞的暂时沟通，形成局部
合子。在部分合子的形成中，提供部分染色体或少数基因的菌称为供体菌， 提供整个染色体的菌称为受体菌；所以 F+和 Hfr 是供体细菌，F-是受体菌。 F+和 F-能杂交，Hfr 和 F-也能杂交，F-和 F-则不能杂交；但这二个可杂交组 合其特性不同，主要表现在：1.Hfr 细菌和 F-细菌杂交以后 F-细菌性质不变， F+和 F-细菌杂交以后 F-细菌转变为 F+（约 70％）。2.F+和 F-细菌杂交重组
频率 10-6，Hfr 和 F-细菌杂交重组频率高出 F+菌株几百倍，称高频重组。
　在 F+与 F-杂交中，F 因子由 F+供体高频转移到 F-受体，低频转移宿主染 色体的标志。原因是 F+群体中每个细胞能转移性因子到 F-受体，只有小部分 细胞能转移染色体的标记。在 Hfr 与 F-杂交中，Hfr 供体的染色体由原点（在
F 因子内）开始转移进入受体菌，在这过程中 F 因子被割裂，F 因子基因，一
些是首先进入，另一些是最后进入。在这类杂交中只有当交配过程长到足以 允许整个供体染色体被转移入 F-受体，受体细胞才能由 F-变为 Hfr。 杂交实验有多种不同方法，这里介绍的是直接混合培养和液体培养。直接
混合培养法操作简单，适用于确定二个菌株间能否杂交或测定重组频率的高 低，而液体培养适宜于细菌的基因定位。
二、实验材料
　大肠杆菌 （EscherichiacoliK12 ）的四个菌株： K12Pro（λ） F+ ； W1485HisIleF+ ； W1177ThrLeuthixylGalaramtl mallacstrr （λ） F- ；
HfrCMetTrp。
　Pro：脯氨酸，（λ）：原噬菌体整合在染色体上，His：组氨酸，ilv： 异亮氨酸缬氨酸，Thr：苏氨酸，Leu：亮氨酸，thi：维生素 B1，xyl：木糖， Gal：半乳糖，ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麦芽糖，lac：乳糖，strr： 链霉素抗性，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。
三、实验器具和药品
1.用具：灭菌培养皿（9 厘米），灭菌三角瓶（150 毫升），灭菌吸管（1、
5、10 毫升），灭菌离心管，灭菌空试管。
2.培养基：
（1）基本培养基 Vogel50×*：MgSO4·7H2O10 克，柠檬酸 100 克，

NaNH4HPO4·4H2O175 克，K2HPO4500 克（K2HPO4·3H2O644 克），蒸馏水约 1，
000 毫升**（配好后放入冰箱保存备用）。
　（2）平板用基本培养基：Vogel50×2 毫升，葡萄糖 2 克，琼脂 2 克***， 蒸馏水 98 毫升，pH7.0，高压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
（3）液体完全培养基（肉汤培养基）：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5
克，蒸馏水 100 毫升，pH7.2，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分钟。
　（4）半固体培养基：琼脂 0.7—1 克，蒸馏水 100 毫升，pH7.0，高压灭 菌 15 磅/英寸 215 分钟。
　　　　　　　　　　　　　　四、实验说明 大肠杆菌中除了不同型细胞的接合外，同型细胞 F+与 F+或*即浓度为使用 浓度的 50 倍。
**将称好的药品分别溶解于 670 毫升蒸馏水中，待一种药品溶解后再放另
一种药品，直至全部药品都溶解，然后加水定容到 1.000 毫升。
　***琼脂的添加量由 1.5—2 克，根据琼脂的质量而定。凝固性能好的琼脂， 可少加一些，反之，则要多加一些。Hfr 与 Hfr 也能接合，但重组频率很低。 细胞中的 F 因子使细胞壁的抗原发生了变化，这些不同于 F 性菌毛的表面成 分阻止了 F+与 F+细胞杂交。经培养后处于饥饿条件下的 F+细胞丧失了它们 的表面排斥性，才能与其它 F+细胞接合（这种改变是暂时的，一旦在新鲜培 养基中，继续生长正常的表面特性又恢复），这些表型上的“F-细胞”称为 拟表型。在抑制新的 F 性菌毛和表面成分形成的条件下生长，如低温下连续
通气培养 24—48 小时，能增加拟表型的百分数。
　1946 年 Lederberg 和 Tatum 开始发现细菌的接合以后，普遍认为 DNA 的转 移必需 F+（Hfr）与 F-细胞的紧密接触。Anderson 等于 1957 年根据电镜照 片指出接合细胞之间形成了桥。之后发现 F+（Hfr）和性菌毛之间的关系， 认为细菌染色体和专一雄性噬菌体通过性菌毛而转移。近来的电镜照片已经 发现接合细胞通过性菌毛接触，并有实验依据。细胞接合后，供体中的 DNA
开始合成。一个单链 DNA 转移入受体并合成一条新的互补链；这过程能以 DNA 复制的滚环模型来说明。
上面提到带有 F 因子的大肠杆菌有 F+和 Hfr 二类，实际上并不是所有的
Hfr 全是相当稳定的，在许多 Hfr 群体中含有回复子，在这些回复子中 F 因 子不再整合在染色体上，而回复到游离状态，当 F 因子脱离寄主染色体时携 带了细菌的基因，例如 lac 和 gal 等，这称之为 F′因子。带有 F′因子的菌 称为 F′菌株。F′菌株也能与 F-杂交，现被广泛应用于细菌的研究工作。
五、实验步骤
1.菌液制备：
　（1）实验前 14—16 小时，从冰箱保存的斜面菌种，挑少量菌于盛有 5 毫 升完全液体培养基的三角烧瓶中；每一个菌株接种一瓶，共接种 4 瓶，置 37
℃培养过夜。
　（2）取出培养过夜的细菌，在 W1177 一瓶菌液中加入 5 毫升新鲜的完全 培养液，充分摇匀，等量分成 2 瓶；其余 3 瓶菌液分别用灭菌的 5 毫升吸管， 各吸出 2.5 毫升菌液，然后再各加入 2.5 毫升新鲜的完全培养液，充分摇匀， 各菌于 37℃继续培养 3—5 小时。
　
　（3）自温箱取出三角烧瓶，分别倒入离心管，菌株 W1177 倒二支离心管， 其余菌株各倒入一支离心管，离心沉淀，3，500 转/分，离心 10 分钟。
　（4）倒去上清液，打匀沉淀，加入无菌水，离心洗涤 3 次，再加无菌水 到原体积。
2.杂交——混合培养：
（1）取 12 支灭菌试管，每支吸入 3 毫升经融化的半固体培养基，并保温
在 45℃（保温温度不宜高，北方气温低，可降低半固体中的琼脂量）。
　（2）12 支试管分成三个杂交组合，即 W1177×K12pro；W1177×W1485； W1177×HfrC。每个组合各 4 支试管，其中 2 支对照，2 支混合菌液。
（3）对照组试管各吸 F+或 Hfr 供体菌菌液 1 毫升，其余按杂交组合各吸
供体菌和受体菌菌液 0.5 毫升，充分混匀。
　（4）将各试管中含菌的半固体倒在有 Vogel 培养基底层的平板上，摇匀 待凝，放 37℃培养，48 小时后观察（图 12－3）。
六、实验结果记录



实验十三大肠杆菌营养缺陷型菌株的筛选
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 在以微生物为材料的遗传学研究中，用某些物理因素或化学因素处理细 菌，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等） 的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。 这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。筛选营养缺陷型菌 株必须经过以下几个步骤：诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴定缺陷 型。由于本实验是以大肠杆菌为材料，所以根据细菌的特性分别说明筛选的 步骤。 诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。物理诱变
剂常用的有 X 射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，
微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。 诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分 布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对 数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。 诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂
量。绝对剂量的单位以尔格/cm2 表示，一般用相对剂量。相对剂量与三个因
素有关，这三个因素是：诱变源和处理微生物的距离，诱变源（紫外灯）的 功率，以及处理的时间。前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变 剂量。各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。 经处理以后的细菌，缺陷型还是相当少的，必须设法淘汰野生型细胞，提 高营养缺陷型细胞所占比例，以达到浓缩缺陷型的目的。细菌中常用的浓缩 法是青霉素法。青霉素是杀菌剂，它只杀死生长的细胞，对不生长的细胞没 有致死作用。所以在含有青霉素的基本培养基中野生型能长而被杀死，缺陷 型不能长被保存得以浓缩。 检出缺陷型的方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培养法。 这里主要以逐个测定法为例进行说明。把经过浓缩的缺陷型菌液接种在完全 培养基上，待长出菌落后将每一菌落分别接种在基本培养基和完全培养基

上。凡是在基本培养基上不能生长而在完全培养基上能长的菌落就是营养缺 陷型。 经初步确定为营养缺陷型的菌用生长谱法鉴定。在同一培养皿上测定一个 缺陷型对多种化合物的需要情况。
二、实验材料
大肠杆菌 K12 的野生型菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）K12SF+。
三、实验器具和药品
1.用具：灭菌培养皿（9 厘米），灭菌三角烧瓶（150 毫升），灭菌吸管
（1.5 毫升），灭菌离心管。
2.培养基：
（1）肉汤液体培养基：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克，蒸馏水
100 毫升，pH7.2，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分钟。
　（2）肉汤液体培养基（ZE）：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克， 蒸馏水 50 毫升，pH7.2，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分钟。
（3）基本液体培养基：Vogel50×2 毫升，葡萄糖 2 克，蒸馏水 98 毫升，
pH7.0，高压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
　（4）基本固体培养基：琼脂 2 克，基本液体培养基 100 毫升，pH7.0，高 压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
（5）无 N 基本液体培养基：K2HPO4O.7 克（或 K2HPO4·3H2O0.92 克），
KH2PO40.3 克，柠檬酸钠·3H2O0.5 克，MgSO4·7H2O0.01 克，葡萄糖 2 克，
蒸馏水 100 毫升，pH7.0，高压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
（6）2N 基本液体培养基*：K2HPO40.7 克（或 K2HPO4·3H2O0.92 克），
KH2PO40.3 克，柠檬酸钠·3H2O0.5 克，MgSO4·7H2O0.01 克，（NH4）2SO40.2
克，葡萄糖 2 克，蒸馏水 100 毫升，pH7.0，高压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
（7）混合氨基酸和混合维生素及核苷酸的配制：氨基酸（包括核苷酸）
分 7 组（I—Ⅶ），其中 6 组（I—VI）每组有 6 种氨基酸（包括核苷酸）， 每种氨基酸（包括核苷酸）等量研细充分混合。第 7 组是脯氨酸，因为这种 氨基酸容易潮解，所以单独成一组。
I. 赖 精 甲硫 半胱 胱 嘌呤 Ⅱ. 组 精 苏 羟脯 甘 嘧啶 Ⅲ. 丙 甲硫 苏 羟脯 甘 丝 IV. 亮 半胱 谷 羟脯 异亮 缬 V. 苯丙 胱 天冬 甘 异亮 酪 VI. 色 嘌呤 嘧啶 丝 缬 酪 Ⅶ. 脯


把维生素 B1、B2、B6，泛酸，对氨基苯甲酸（BAPA），烟碱酸及生物素等
量研细，充分混合，配成混合维生素。
　3.生理盐水：NaClO.85 克，蒸馏水 100 毫升，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分 钟*。
四、实验说明

　微生物中筛选营养缺陷型的步骤包括诱变处理、淘汰野生型、检出缺陷 型、鉴定缺陷型四步。由于不同微生物和诱变剂的特性差异，所以在实际工 作中，应根据具体情况而适当变动，现分别补充说明。 当选用化科诱变剂进行诱变处理时，首先应根据诱变剂的特性，确定用何 种诱变剂。化学诱变剂根据它们的诱变作用可以区分为三种：1.通过掺入 DNA 分子而引起突变，必须通过代谢作用。属于这一类的诱变物质如碱基类似物。
2.通过和 DNA 直接起化学反应而引起突变。多数化学诱变剂属于这一类如亚 硝酸等。3.通过一对核苷酸的插入或缺失而引起突变如吖啶类物质。 化学诱变剂的剂量也以相对剂量表示。相对剂量与三个因素有关：诱变剂 浓度，处理温度和处理时间。一般通过处理时间来控制剂量。处理前诱变剂 和菌液分别预热，以便当二者混合后即可计算处理时间，才能精确控制剂量。 处理时间应按不同的处理菌而有所区别，最适剂量应事先进行预备试验确 定。
　浓缩缺陷型的方法有青霉素法、菌丝过滤法，差别杀菌法、饥饿法等，这 些方法适用于不同的微生物。细菌应用青霉素浓缩法，酵母菌和霉菌的缺陷 型筛选可以用制霉素代替青霉素。放线菌和霉菌可用菌丝过滤法，它们的野 生型孢子能在基本培养液中萌发并长成菌丝，缺陷型的孢子不能长成菌丝。 所以把经诱变处理的孢子悬浮在基本培养液中振荡培养，在培养过程中过滤 几次，每次培养时间不宜过长，这样才能充分浓缩。
*高渗青霉素法在 2N 基本培养液中加 20％蔗糖和 0.2％MgSO4·7H2O。
　营养缺陷型的检出方法有逐个测定法、夹层培养法、限量补给法、影印培 养法等。现简述如下：夹层培养法，先在皿底倒一层不含细菌的基本培养基， 待凝后加上一层含菌的基本培养基，冷凝后再加上一层不含菌的基本培养 基。经培养出现菌落以后在培养皿底上把菌落做上标记，然后加上一层完全 培养基，再经培养以后出现的菌落多数是营养缺陷型。影印培养法，将经处 理的细菌涂在完全培养基的表面，待出现菌落以后，用灭菌丝绒将菌落影印 接种到基本培养基表面。待菌落出现以后比较两个培养皿，凡在完全培养基 上出现菌落而在基本培养基上的同一位置上不出现菌落者，这一菌落便可以 初步断定是一个缺陷型。
　

1.菌液制备：

五、实验步骤

（l）实验前 14—16 小时，挑取少量 K12SF+菌，接种于盛有 5 毫升肉汤培
养液的三角瓶中，置 37℃培养过夜。
　（2）第二天添加 5 毫升新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，分装 2 只三角 瓶，继续培养 5 小时。
　（3）将两只三角瓶的菌液分别倒入离心管中，离心（3，500 转/分）10 分钟。
　（4）倒去上清液，打匀沉淀。其中一管吸入 5 毫升生理盐水，然后倒入 另一离心管，二管并成一管。
2.诱变处理：
　（1）吸上述菌液 3 毫升于培养皿内，将培养皿放在 15W 的紫外灯下。距 离 28.5 厘米。
（2）处理前先开紫外灯稳定 30 分钟，将待处理的培养皿连盖放在灯下灭

菌 1 分钟，然后开盖处理 1 分钟。照射毕先盖上皿盖，再关紫外灯。
　（3）吸 3 毫升加倍肉汤培养液到上述处理后的培养皿中。置 37℃温箱内， 避光培养 12 小时以上。
3.青霉素法淘汰野生型：
　（1）吸 5 毫升处理过的菌液予已灭菌的离心管，离心（3，500 转/分）10 分钟。
　（2）倒去上清液，打匀沉淀，加入生理盐水，离心洗涤三次，加生理盐 水到原体积。
　（3）吸取经离心洗涤的菌液 0.1 毫升于 5 毫升无 N 基本培养液，37℃培 养 12 小时。
　（4）培养 12 小时后，按 1∶1 加入 2N 基本培养液 5 毫升，称取青霉素钠 盐，使青霉素在菌液中的最终浓度约为 1.000 单位/毫升，再放入 37℃温箱 中培养。
　（5）先从培养 12、16、24 小时的菌液中各取 0.1 毫升菌液倒在两个灭菌 培养皿中，再分别倒入经融化并冷却到 40－50℃的基本及完全培养基，摇匀 放平，待凝固后，放入 37℃温箱中培养（培养皿上注明取样时间）。
4.缺陷型的检出：
　（1）以上平板培养 36—48 小时后，进行菌落计数。选用完全培养基上长 出的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用接种针挑取完全培养基上长出 的菌落 80 个，分别点种于基本培养基与完全培养基平板上，先基本后完全， 依次点种，放 37℃温箱培养。
（2）培养 12 小时后，选在基本培养基上不生长、而在完全培养基上生长
的菌落，再在基本培养基的平板上划线，37℃温箱培养，24 小时后不生长的 可能是营养缺陷型。
5.生长谱鉴定：
（1）将可能是缺陷型的菌落接种于盛有 5 毫升肉汤培养液的离心管中，
37℃培养 14—16 小时。（2）培养 16 小时后，离心（3500 转/分）10 分钟， 倒去上清液，打匀沉淀，然后离心洗涤三次，最后加生理盐水到原体积。
（3）吸取经离心洗涤的菌液 1 毫升于一灭菌的培养皿中，然后倒入融化
后冷却至 40—50℃的基本培养基，摇匀放平，待凝，共做两皿。
　（4）将 2 只培养皿的皿底等分 8 格，依次放入混合氨基酸（包括核苷酸）， 混合维生素和脯氨酸（加量要很少，否则会抑制菌的生长），然后放 37℃温 箱培养 24—48 小时，观察生长圈，并确定是哪种营养缺陷型（见图 13-1）。 六、实验结果记录
1.诱变处理的记录：
　　取样时间 培养基 菌 落 数 12 小时 16 小时 24 小时 ［+］
［-］



2.生长谱鉴定的记录：


你所鉴定的缺陷型是哪种缺陷型，生长圈在哪个区。

实验十四啤酒酵母菌营养缺陷型菌株的筛选
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 利用化学诱变剂诱发突变是遗传学研究和育种工作的常用手段。 化学诱变剂按其诱变机理一般可分为三类：（1）通过掺入 DNA 分子引起 突变，（2）通过和 DNA 直接起化学反应后引起突变，（3）通过一对核苷酸 的插入或缺失引起突变。本实验以烷化剂亚硝基胍（nitrosoguanidine，NTG） 为诱变源，它的诱变机理属于第二类。现在一般认为烷化剂的诱变机理主要 是由于对鸟嘌呤 N-7 位置上的烷化作用（鸟嘌呤其它位置以及其它碱基的许 多位置也可能被烷化），然后被烷化的碱基同碱基结构类似物作用机制一样， 通过 DNA 复制，引起碱基错误配对导致碱基转换或颠换造成基因突变。通常 烷化后的碱基（G）偶然与胸腺嘧啶（T）错误配对代替胞嘧啶（C）。
NTG 主要诱发 GC—AT 的转换。它除有较强的诱变作用外，还能诱发邻近位
置基因的并发突变，而且特别容易诱发 DNA 复制叉附近的基因突变，随着复 制叉的移动，它的作用位置也随着移动。
NTG 是一种超诱变剂，它的诱发效率可使百分之几十的细菌发生营养缺陷
型突变，因此经 NTG 处理的细菌不必经过青霉素浓缩处理，而只要通过适当 的筛选方法就能检出营养缺陷型。一般讲，一种高效率的诱变剂，只要有一 种有效的筛选方法是可以获得任何突变型的。 诱变处理所用的细胞一般为对数期细胞。化学诱变剂的剂量一般以药物浓 度表示。一定的剂量有一定的杀菌率和诱变率，通过杀菌率和诱变率可帮助 我们了解一定剂量的诱变作用。诱变作用往往与药物处理时间和温度有关。 具有较强诱变作用，较弱杀菌作用的诱变剂（如烷化剂）可采用较低剂量（约
50％的杀菌率），反之，紫外线一般采用较高杀菌作用的剂量（如 90％—99.9
％杀菌率）。
二、实验材料
1.啤酒酵母菌单倍体 26－4（来自上海酵母厂）。
2.啤酒酵母菌单倍体 143—2（来自上海酵母厂）。 三、实验器具和药品
1.用具：培养皿（9 厘米），三角瓶（150 毫升），试管，离心管，吸管
（1 毫升、5 毫升），玻璃涂棒，玻璃珠，丝绒布，圆木柱。
2.培养基
（1）基本培养基：葡萄糖 10 克，CaCl2·2H2O0.1 克，KH2PO40.876 克，
（NH4）2SO41 克，K2HPO40.125 克，MgSO4·7H2O0.5 克，NaClO.1 克，KI 母
液 1 毫升，微量元素母液 1 毫升，维生素母液 1 毫升，蒸馏水加到 1000 毫升。 高压灭菌 8 磅 25 分钟。
注：①碘化钾母液：1 克/毫升。

②微量元素母液：H3BO3（硼酸）1 毫克/100 毫升、ZnSO4·7H2O（硫酸锌）
7 毫克/100 毫升、CuSO4·5H2O（疏酸铜）1 毫克/100 毫升、CoCl2·6H2O（氯
化钴）5 毫克/100 毫升。
③维生素母液：维生素 B140 毫克/100 毫升、烟碱酸 40 毫克/100 毫升、
肌醇 200 毫克/100 毫升、核黄素 20 毫克/100 毫升、对-氨基甲酸 20 毫克/100 毫升、吡哆醇 40 毫克/100 毫升、泛酸 20 毫克/100 毫升、生物素 3 毫克/100 毫升。以上三种母液都需高压灭菌 15 磅 15 分钟。
（2）基本固体培养基：在上述培养基加 2％琼脂即可。
　（3）完全液体培养基：蛋白胨 20 克、酵母浸出汁 10 克、葡萄糖 20 克、 蒸馏水 1000 毫升，pH6.0，高压灭菌 8 磅 25 分钟。
（4）完全固体培养基：在上述培养基加 2％琼脂即可。
（5）无菌水
（6）生理盐水（0.85％）
（7）0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）：0.2mol/LNa2HPO412.3 毫升、
0.2mol/LNaH2PO487.7 毫升。
3.诱变剂：亚硝基胍（NTG）。 四、实验说明
1.本实验采用的诱变剂是一种超诱变剂，因此安全操作十分重要。称量
时，最好在某一固定地方，戴好橡皮手套和口罩在密闭箱里进行，以防止 NTG 颗粒吹散。操作时，不能用嘴直接吸取含有 NTG 的液体，应改用洗耳球吸取。 凡含有 NTG 的器皿和用具都要用浓碱处理。
2.利用酵母菌进行诱变工作，首先要获得单倍体菌株。在二倍体细胞中，
隐性性状（突变往往是隐性）不能表现。而单倍体细胞，隐性突变性状就能 直接表现。因此，获得单倍体细胞对诱变工作来说是重要的。 一个简单的办法是：利用营养细胞和子囊孢子的耐热性差异进行热处理， 就能很容易得到单倍体细胞。具体做法是把二倍体营养细胞接种于产孢子培 养基的斜面上，用 5 毫升无菌水制成悬浊液，将此悬浊液浸于 55℃—60℃恒 温水浴中，不断振荡处理约 10 分钟（处理时间，根据对营养细胞耐热性预备
试验而定。一般以约 106—107 的营养细胞菌悬液经一定时间处理后，用接种
环挑取一环菌液接种于完全平板或斜面，30℃培养 2 天后，看完全不生长或 只有一两个菌落生长为标准作为所需的处理时间）。处理后，用自来水迅速 冷却，适当稀释涂布于完全培养基平板，30℃培养 2 天后，用接种环挑取较 小的圆锥形菌落镜检，从形态上判断单倍体细胞。用这方法，一般要划线纯 化后较为可靠。为了进一步提高可靠性，可接种于产孢子培养基上看是否产 孢子来确定。如先用一定浓度的纤维素酶处理，再进行热处理可提高获得单 倍体细胞的效率。


1.制备菌悬液

五、实验步骤

（1）将酵母菌单倍体菌株#26—4（或 143—2）从保存斜面上，用接种环
挑一些菌，接种到盛有 5 毫升完全液体培养液的灭菌离心管中，28℃—30℃ 培养 16—18 小时，共接 2 支。
　（2）将培养过的菌液倒入盛有玻璃珠的灭菌三角瓶中，振荡 10 分钟，使 酵母菌充分均匀分散。
　
　（3）将上述菌液各吸 4 毫升于 2 支灭菌离心管中离心（3500 转/分，10 分钟），倒去上清液，打匀菌块，各加 4ml 无菌水制成菌悬液，并存放在 30
℃水浴中备用。
2.活菌计算（用没有经 NTG 处理的菌液作对照）
　（l）从 30℃水浴中取出一支菌悬液（4 毫升），加生理盐水 1 毫升，然 后再用生理盐水稀释到 10-4、10-5。
（2）从 10-4 或 10-5 稀释液中吸取 0.1 和 0.5 毫升于灭菌培养皿中，各
做二皿，共四皿。
　（3）将熔化不烫手的完全固体培养基倒入上述含菌的培养皿中（每皿约 倒入培养基 15—20 毫升），摇匀、放平待凝，30℃培养二天，计算活菌数。
3.诱变处理
　（1）称取 NTG1.5 毫克于灭菌的离心管中，然后加入 1 毫升 pH6.00.2mol/L 磷酸缓冲液，使其完全溶解，并存放在 30℃水浴中备用。
　（2）从 30℃水浴中取出另一支菌悬液（4 毫升），倒入上述含有 NTG 的 离心管中（此时 NTG 最终浓度为 300γ/毫升），充分混匀，立刻放入 30℃水 浴中，同时计算时间，30 分钟后取出，立即离心（3500 转/分），将上述废 液倒入浓 NaOH 溶液中，打匀菌块，加 5 毫升生理盐水，再离心（3500 转/分） 一次，倒去废液，加 5 毫升无菌水制成菌悬液。
（3）将熔化不烫手的完全培养基倒入灭菌培养皿中（每皿 15—20 毫升），
放平待凝，共 20 皿。
（4）将经 NTG 处理过的菌液稀释为 10-3（希望每只培养皿中长 50—100
个菌落），吸取 0.1 毫升和 0.05 毫升于上述预先倒好的培养皿中，各倒 10 个皿。
（5）用灭过菌的 Y 形玻璃涂棒将菌液涂匀，30℃培养 3—4 天，计算活菌
数。
　（6）计算杀菌率及存活率（从诱变组中选择不污染、菌落分布均匀、菌 数适中的培养皿留作下步影印备用）。
4.影印
（1）准备好影印用丝绒布（高压灭菌，干燥箱内烘干备用）。
　（2）将一定数量的母平板和预先准备好的基本培养基及完全培养基平 板，以一个母平板，一个基本平板，一个完全平板作为一组，每组编号，并 在每个平板的底部用玻璃铅笔划上箭头作为标记。
（3）将灭菌的丝绒布放在圆本柱上，用橡皮筋扣住（注意绒面不能用手
摸），先取母平板倒复在绒面上，然后用铅笔轻轻在皿底上均匀地敲几下， 取下母平板（放冰箱保存起来），立即把 MM 平板（基本培养基平板）按箭头 标记的相同方向复印上去（方法同上），取下 MM 平板，再把 CM 平板（完全 培养基平板）也按上述同样方法复印，印毕，30℃培养 2—3 天。影印见图
14－l。
5.点种复证
　（1）将每组复印的平板按箭头标记的同一方向进行比较，找出 CM 平板上 生长而 MM 平板上不生长的相应菌落，用玻璃铅笔在相应位置的母平板上作上 记号，并编号，以便进一步复证。
（2）准备 MM 平板和 CM 平板，平板数量可根据编号菌落多少而定，一个

皿可划 36 个格子左右。
　（3）用灭菌牙签从母平板上挑取已编号的单菌落，按顺序在 MM 和 CM 平 板上的相应位置上点种，点毕，30℃培养 2—3 天左右。
　（4）从温箱中取出培养皿，用接种环挑取确实只能在 CM 上生长而 MM 上 不生长的单菌落接种于 CM 斜面，30℃培养 2 天 后放冰箱保存，供生长谱鉴定用。
　6.生长谱鉴定方法与微生物大肠杆菌诱变营养缺陷型的鉴定方法相同，所 以从略。
六、实验结果


处 理 皿数 稀释 取样 活菌总数 存活菌数 突变型数 杀菌率 诱变率 菌数/
皿 菌数
/毫升 菌数/
皿 菌数
/毫升 菌数
/皿 菌数
/毫升

对 照 4 10-4
或
10-5 0.5

0.1

0.5

0.1 NTG
（ 300 γ毫升 30
℃ 30 分钟） 20 10-3 0.05

0.1




杀菌率：?1 ?
?

存活菌数?
活菌总数? ×100%


诱变率：

突变型数 / 毫升 活菌总数 / 毫升


×100%



实验十五细菌转导（局限性转导）
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 随着分子遗传学的发展，转导已成为遗传学分析的常用方法。所谓转导就 是利用噬菌体为媒介将一个细胞（供体）的遗传物质传递给另一个细胞（受 体）的过程。转导可分为二类：（1）普遍性转导；（2）局限性转导（专一 性转导）。本实验以局限性转导为例，用λ噬菌体专一性转导半乳糖发酵基 因的现象来说明转导的基本原理，并初步掌握转导实验的基本技术。实验中
所采用的供体菌株是 E.coliK12（λ）gal+。当此细菌受紫外线诱导后，原
噬菌体被释放出来，其中有一定比例的噬菌体带有邻近的半乳糖发酵基因， 我们称这种噬菌体为转导噬菌体（即λdggal+）。当转导噬菌体（λdggal+） 感染受体菌 E.coliK12gal-时，少部分（约三分之一）形成稳定的转导子， 大部分（约三分之二）以杂基因子的形式形成不稳定的转导子。整个转导过
程见图 15-1。
二、实验材料
1.E.coliK12（λ）gal+（大肠杆菌 K12 带有整合在半乳糖基因旁的λ原
噬菌体溶源菌）

E.coliK12Sgal-（大肠杆菌 K12 染色体上半乳糖基因缺陷） 三、实验器具和药品
　1.用具：培养皿（9 厘米），三角瓶（150 毫升），试管（15×1.5），离 心管，吸管（1 毫升、5 毫升、10 毫升），玻璃涂棒。
2.培养基
　（1）肉汤液体培养基：牛肉膏 5 克，蛋白胨 10 克，NaCl5 克，蒸馏水 1000 毫升，pH7.0－7.2，高压灭菌 15 磅 15 分钟。
　（2）加倍肉汤液体培养基（2E）：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克，蒸馏水 50 毫升，pH7.0—7.2，高压灭菌 15 磅 15 分钟。
（3）肉汤半固体培养基：肉汤液体培养基中加 1％的琼脂。
（4）肉汤固体培养基：肉汤液体培养基中加 2％的琼脂。
（5）半乳糖 EMB 培养基：伊红 Y0.4 克，美蓝 0.06 克，半乳糖 10 克，多
胨 10 克，K2HPO42 克，琼脂 20 克，蒸馏水 1000 毫升，pH7.0—7.2，高压灭
菌 8 磅 25 分钟。
（6）Vogel50×基本培养基（浓缩 50 倍的基本培养基）：MgSO4·7H2O10
克，柠檬酸 100 克，NaNH4HPO4·4H2O175 克
K2HPO4500 克，蒸馏水定容 1000 毫升（配好后放冰箱备用）。
（7）半乳糖基本固体培养基：Vogal50×2 毫升，半乳糖 2 克，优质琼脂
粉 1.8 克，蒸馏水 98 毫升，pH7.0，高压灭菌 8 磅 25 分钟。
（8）磷酸缓冲液：KH2PO42 克，K2HPO47 克，MgSO4·7H2O0.25 克，蒸馏
水 1000 毫升，高压灭菌 15 磅 15 分钟。
（9）生理盐水：NaCl8.5 克，蒸馏水 1000 毫升，高压灭菌 15 磅 15 分钟。
（10）药品：氯仿。
四、实验说明
　1.局限性转导可分为低频转导（LFT）和高频转导（HFT）。从低频转导的 转导子中可分离得到用于高频转导的双重溶源化细菌，以双重溶源菌诱导制 得λ噬菌体裂解液进行转导试验就称其为高频转导。 在低频转导中，用于转导的λ噬菌体大部分属正常的噬菌体（λ+），只 有少数属部分缺失的转导噬菌体（λdggal+）。当大量噬菌体感染受体菌时，
大部分受体菌被正常的噬菌体感染裂解死亡。尽管少部分被转导噬菌体感 染，由于大量正常噬菌体的存在，往往同时也被正常噬菌体感染裂解死亡， 一般认为：只有部分同时感染的细胞，首先λ+通过正常的附着位点整合到受 体菌染色体上，然后，λdggal+的杂合附着位点和染色体上的杂合附着位点
（由于λ+整合造成）再次整合形成不稳定杂基因子（双重溶源化细菌）整个
过程见图 15-2：
　低频转导的转导频率较低，一般在 106 的感染细胞中有一个转导子出现。 如改用双重溶源菌株进行诱导制备λ裂解液进行转导，情形就不同。由于λ+
的存在使得λdg 同时成熟，裂解液中就会出现 50％正常噬菌体和 50％部分
缺失的λdggal+转导噬菌体，因此可以得到约 50％的转导子，从而大大提高
了转导频率。
　2.λ溶源菌株的获得可通过较为简单的办法得到：用较高浓度的λ裂解液 和用于转导的供体菌混合涂布于完全固体平板，同时做λ噬菌体和供体菌的
　
对照。37℃培养过夜后，第二天就能看到混合涂布的平板出现单菌落，而对 照涂布λ噬菌体平板无菌落、涂布供体菌平板呈现一片菌落。单菌落的出现 是由于大量λ噬菌体把被感染的菌大都裂解掉，而只有少部分对λ噬菌体抗 性菌落和λ溶源菌才能生长。只要区分这二种菌落，就能获得所需要的λ溶 源菌株。一个简单的办法是把各个单菌落接种于一定体积的完全培养液中，
37℃培养一定时间，然后离心除去上清液，用完全培养液制成菌悬液（菌液
可浓一些，也可加入一定量的 0.1mol/LCaCl2），各挑取一环菌液滴加于涂
有菌液（对λ噬菌体敏感的指示菌）的完全固体平板上，然后以一定距离的 U、V 照射，37℃培养过夜，第二天观察是否有噬菌斑出现，如果噬菌斑出现，
表明相应的单菌落是λ溶源菌，反之是λ噬菌体抗性菌。 同样，对低频转导的转导子进行上述的实验就能分离到高频转导的双重溶 源菌，因为双重溶源的转导子经 U、V 照射也将会释放λ噬菌体感染敏感细菌 而产生噬菌斑，相反，其它转导子经 U、V 照射不释放λ噬菌体不形成噬菌斑， 这样我们将容易区分这种状态的转导子，而获得我们所需要的双重溶源性菌
株。


1.噬菌体裂解液的制备

五、实验步骤

（1）前一夜挑取一环供体菌（K12（λ）gal+）接种于含有 5 毫升肉汤培
养液的试管中，37℃培养过夜，然后吸取 0.5 毫升菌液于含有 4.5 毫升肉汤 培养液的三角瓶中，继续培养 3—4 小时。
（2）将三角瓶的菌液倒入离心管，3500 转/分离心 10 分钟。
（3）除去上清液，加 4 毫升磷酸缓冲液，制备菌悬液。
　（4）取菌悬液 3 毫升于灭菌培养皿中，经 U、V（15W、距离 40 厘米）处 理，诱导 10 分钟。
（5）处理后加入 3 毫升 2E 肉汤培养液，37℃避光培养 3－5 小时。
　（6）吸取培养液于灭菌离心管中，3500 转/分离心 10 分钟，然后小心吸 取上清液于另一支塞有软木塞的灭菌离心管中，加入 0.2 毫升氯仿（4—5 滴），剧烈振荡半分钟，静止 5 分钟，小心把上清液用无菌吸管移入另一支 灭菌试管（即λ噬菌体裂解液），供效价测定和转导用。
2.λ噬菌体的效价测定（λ噬菌体总数/毫升）
（1）前一夜挑取一环受体菌（K12gal-）接种于含有 5 毫升肉汤培养液的
试管中，37℃培养过夜。
（2）吸取 0.5 毫升培养液于含有 0.25 毫升 0.1mol/LCaCl2 的 4.5 毫升肉
汤培养液的三角瓶中，继续培养 3—4 小时。
　（3）取已经熔化并于 45℃保温的半固体琼脂试管（每管 3 毫升）4 支， 每支试管加入上述经活化后菌液 0.5 毫升。
（4）吸取λ噬菌体裂解液 0.5 毫升于含有 4.5 毫升肉汤培养液的试管中，
依次稀释到 10-6 与 10-7。
（5）从 10-6 和 10-7 试管中分别吸取 0.5 毫升于上述已加有菌的半固体
试管中（每个稀释度 2 支），搓匀、分别倒入预先倒好并已凝固的肉汤固体 培养基上，摇匀、待凝、37℃培养过夜。
　（6）观察出现噬菌斑数，并估计λ噬菌体裂解液的效价（λ噬菌体数/每 毫升）。
　
3.转导 A.点滴法：
　（1）取预先倒好的 EMB 培养基二皿，在皿底用玻璃铅笔按下图的样子画 好。
　（2）取受体菌（经活化后菌液）一环，按上述图示涂二条菌带，37℃培 养 1.5 小时。
　（3）从温箱中取出培养皿，在二个圆圈和四个方格处，各滴加一环λ噬 菌体裂解液（先滴加圆圈处再滴加方格处），圆圈处为λ噬菌体对照，方格 处为转导试验，菌带为受体菌对照，37℃培养二天，观察结果。
B.涂布法：
　（1）取预先倒好的 EMB 培养基四皿，其中一皿加 0.1 毫升λ噬菌体裂解 液，用于对照；一皿加 0.1 毫升经活化后受体菌，也用于对照；另二皿加λ 噬菌体裂解液和受体菌各 0.05 毫升。
　（2）用 3 支灭菌玻璃涂棒涂布上述各组培养皿，37℃培养二天，观察结 果。
C.平板注入法：
（1）将λ噬菌体裂解液用肉汤稀释为 10-1、10-2、10-3、10-4，从各稀
释度吸取 2 毫升裂解液于含有 2 毫升经活化后受体菌的离心管中，同时以只 加λ噬菌体裂解液（2 毫升 10-1 裂解液加 2 毫升肉汤培养液）和只加受体菌
（2 毫升经活化后受体菌加 2 毫升肉汤培养液）为对照。共六支灭菌离心管，
37℃保温 15 分钟。
　（2）取出上述 6 支离心管，3500 转/分离心 10 分钟，弃上清液，打匀菌 块，用生理盐水洗涤一次，3500 转/分离心 10 分钟，弃上清液，打匀菌块， 各加 2 毫升生理盐水制成菌悬液。
（3）从上述菌悬液中各吸取 0.1 毫升于预先倒好的半乳糖基本固体培养
基中（转导各二皿，对照各一皿，共 10 皿），用六支灭菌玻璃涂棒涂布上述 各组培养皿，37℃培养二天，观察结果，计算出现的转导子数。
六、实验结果
1.λ噬菌体效价（λ噬菌体数/毫升）：

2.转导试验：

点 滴 法 涂 布 法
转 导

试 验 受体菌

菌落生长情况
菌落色泽发酵 情 况
转导频率

噬菌体
裂解液

λ裂解液
+受体菌

受体菌 λ裂解 λ裂解液
+受体菌

平 板 注 入 法
转 导
转 导 子 数/皿



转导子

试 验 受体菌 λ裂解液


菌落生长情况
菌落色泽发酵 情 况
转导频率


10-1 10-2 10-3 10-4

数＼毫升






转导频率 ?

转导子数 / 毫升
噬菌体总数 / 毫升

×100%

实验十六大肠杆菌的重组子遗传分析
一、实验原理
在大肠杆菌的 Hfr 与 F-接合中，供体 Hfr 细菌的染色体转移到受体 F-细
菌去的过程中，为了减少供体亲本细菌的数量，必须抑制它的生长，即对供 体菌进行反选择。所以供体要用不同于受体 F-的营养缺陷型菌株，或对某种 抗菌素及噬菌体敏感的菌，以作反选择的性状。
根据遗传学的研究知道大肠杆菌的染色体是环状的、封闭的单倍基因组
（见图 16-1）。在 Hfr×F-中，Hfr 的染色体由原点起向 F-转移，Hfr 细菌 的基因按一定的顺序依次地出现在 F-受体（见图 16-2）。离原点较近的基因 先进入 F-受体，重组频率较高，出现的重组子多；离原点远的基因进入 F-
细胞迟，重组频率低，出现的重组子少。据此，我们可以进行基因定位。


　大肠杆菌的杂交必须通过不同型细胞的接触，但在接合过程中，细胞会分 离，供体菌的染色体在转移过程中会自发断裂，故 Hfr 菌的基因在重组子中 呈梯度出现，也提供了基因定位的可能性（见图 16-3）。
Hfr×F-中，接合的随机中断，导致重组子分布。
转移起点在 Pro 和 Lac 之间，表示含有不同长度的转移的染色体片段。 大肠杆菌的重组频率较低，即使是高频重组，其重组频率也在 10-3—10-
4 之间。为了在一个较大的杂交群体中发现为数较少的重组子，就要应用选
择性培养基。供体亲本细胞，在选择性培养基上不能生长，只有重组子能长， 因此在选择性培养基上长的菌落即为重组子。所以选样性培养基的确定与选 择性标记有关，选择性标记有营养缺陷、糖发酵、抗药性标记等；相应的选 择性培养基有基本培养基、伊红美蓝培养基以及培养基中加某种抗菌素或药

物等。根据实验要求来确定选择性标记和选择性培养基。在我们的实验中以 营养缺陷为选择性标记，基本培养基是选择性培养基，在基本培养基上长的 菌即为重组子。然后再分析一定数量的重组子中各非选择性标记的分离。在 我们的实验中，选用各种糖发酵基因作为非选择性标记，根据各非选择性标 记的重组百分数，确定这些糖发酵基因在染色体上的位置。 这个试验的适宜条件是在新鲜的肉汤培养液中，以 4×108/毫升的 F-细菌
和 2×107/毫升的 Hfr 菌混合，其比例是 1 个 Hfr 菌对 20 个 F-菌，37℃通气
接触 100 分钟。然后稀释取样，以使每皿得到适量的重组子作为母平板，再 用影印培养法分析非选择性标记的分离。
二、实验材料
大 肠 杆 菌 （ E.coliK12 ） 的 二 个 营 养 缺 陷 突 变 型 菌 株 ：
W1177ThrLeuthixylgalaramtlmallacstrr（λ）F-；HfrCMetTrp。
Thr：苏氨酸，Leu：高氨酸，thi：维生素 B1，xy1：木糖，gal：半乳糖，
ara：阿拉伯糖，mtl：甘露醇，mal：麦芽糖，lac：乳糖，strr：链霉素抗
性，（λ）：原噬菌体整合在宿主染色体上，Met：甲硫氨酸，Trp：色氨酸。 三、实验器具和药品
1.用具：培养皿（9 厘米），灭菌三角瓶（150 毫升），灭菌吸管（1、5
毫升），灭菌离心管，灭菌空试管，圆木柱，丝绒。
2.培养基
（1）液体完全培养基：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克，蒸馏水
100 毫升，pH7.2，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分钟。
（2）固体基本培养基：Vogel50×2 毫升，葡萄糖 2 克，琼脂 2 克，蒸馏
水 98 毫升，pH7.0，高压灭菌 8 磅/英寸 230 分钟。
　（3）EMB 培养基（eosinmethyleneblue 伊红美蓝）：糖*1 克，蛋白胨 0.8 克，NaCl0.5 克，K2HPO40.2 克，伊红 0.04 克，美蓝 0.0065 克，琼脂 2 克， 蒸馏水 100 毫升，pH7.2，高压灭菌 8 磅/英寸 220 分钟。
（4）NaN3 培养基：牛肉膏 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克，
NaN30.002mol/L，琼脂 2 克，蒸馏水 100 毫升，pH7.2，高压灭菌 15 磅/英寸
215 分钟。
（5）半固体培养基：琼脂 1 克，蒸馏水 100 毫升，高压灭菌 15 磅/英寸
215 分钟。
3.生理盐水：NaCl0.85 克，蒸馏水 100 毫升，高压灭菌 15 磅/英寸 215 分
钟。
*此处所用的糖分别为木糖（xyl），半乳糖（gal），阿拉伯糖（ara），
甘露醇（mtl），麦芽糖（mal），乳糖（lac）。 四、实验说明
　大肠杆菌的基因定位，除了根据供体基因在受体中的梯度出现而定位外， 还可用中断杂交的方法以及根据基因重组计算重组频率来定位。
Hfr 菌与 F-接合，可根据供体各个基因进入受体的时间而定位。若我们于
不同时间中断成对的接触细胞，然后取样在各种不同的选择性培养基上培 养，最后统计各种选择性培养基上长出的菌落数。我们发现每个 Hfr 菌株染

色体标记的转移有一定的顺序和时间推迟。同时证明了 Hfr 菌株的多样性， 表现在转移起点、转移方面和标记的顺序不同。这主要是由于 F 因子整合入 寄主染色体的不同位置，并以不同方向整合的结果（图 16-4）。 中断杂交的结果是供体菌的基因于接合后的不同特定时间在受体中出 现，而且供体菌的基因以一定顺序出现。后进入受体的标记的出现频率低于 先进入的标记（见图 16-5）。当二个标记的距离少于二分钟，中断杂交的方 法是不可靠的，一般通过计算重组频率来定位。 中断杂交和基因梯度转移这二个杂交方法中，以供体菌前端二个基因为选 择性标记。所以在杂交过程中只要 Hfr 细菌的前端两个选择性标记进 F-细 菌，就能得到一个重组子，不管其他基因有没有进入 F-细菌。而要测定基因 重组，则进入受体的 Hfr 染色体片段应是相同长度的，也就是说以这一片段 的第一个基因和最后的一个基因作为选择性标记。分析这一杂交的重组子中 的基因组合，计算出它们的重组频率，根据重组频率确定基因在染色体上的 位置。例如 Hfrade+leu+strs×F-ade-leu-strr 中重组频率的计算。
ade ? leu ?
重组频率 ? ?ade? leu ? ? ? ?ade ? leu ? ?
　　　　　　　　　　　　　五、实验步骤 重组子遗传分析的实验步骤见图 16-6。
1.菌液制备
　（1）实验前 14—16 小时从冰箱保存的斜面菌种挑少量菌，接种于盛有 5 毫升液体完全培养基的三角烧瓶中，置 37℃培养过夜。
（2）第二天取出菌液，分别先吸出 2.5 毫升菌液，再各加入 2.5 毫升新
鲜的液体培养基，充分摇匀，继续培养 3—5 小时。
（3）自温箱取出三角瓶，分别倒入灭菌离心管，3500 转/分离心 10 分钟。
（4）倒去上清液，打匀沉淀，各加入新鲜的完全液体培养基到原体积。
（5）从 W1177 与 HfrC 各取 4.5 毫升和 0.5 毫升菌液，放入一个灭菌的经
37℃预热的三角瓶中，充分摇匀。
2.液体培养——杂交
　（1）实验开始前，调节两只水浴锅，温度分别为 37℃和 45℃，并保持恒 温。
（2）将盛混合菌液的三角瓶置于 37℃水浴中，保温 100 分钟。
　（3）融化半固体培养基，并取 4 支灭菌空试管，每支吸入 3 毫升半固体 培养基，于 45℃水浴保温。
　（4）液体培养 100 分钟后，取出三角瓶，用 1 毫升吸管吸取 0.1 毫升混 合菌液，放入 1 支半固体培养基，搓匀，倒入已加 Vogel 底层的培养皿中， 摇匀，凝固后，37℃培养 48 小时，观察出现的重组子。重复两皿。
　（5）取 HfrC 菌离心沉淀，倒去上清液，再离心洗涤三次，打匀沉淀，加 入灭菌生理盐水到原体积，用 1 毫升吸管吸取 0.1 毫升 HfrC 菌液，放入半固 体培养基，搓匀，倒入已加 Vogel 底层的培养皿中，摇匀。凝固后，37℃培
养 48 小时，观察是否长菌落，作为对照。重复两皿。
3.重组子的遗传分析
　（1）取 2 只灭菌的培养皿，倒入 Vogel 培养基，待凝固后用接种针挑取 重组子菌落，依次接种到有 Vogel 培养基的培养皿上（每皿 80 个菌落），37
　
℃培养 24 小时，作影印培养的原始培养皿。
（2）融化 EMB 培养基（包括 6 种糖原）和 NaN3 培养基，每种培养基倒 2
只培养皿，共 14 只培养皿。
　（3）取灭菌的丝绒一块，固定在圆柱形木块上，将原始培养皿倒置覆盖 在丝绒上，用笔轻敲皿底。一块丝绒复制 2 只相同培养基的培养皿。当影印 不同培养基的培养皿时，应另换一块灭菌的丝绒，重复操作，直至全部影印 完毕。经影印的培养皿，放在 37℃培养 24 小时，观察各种性状出现的比例。 六、实验结果记录
　
1.杂交结果：
菌落数 组合
皿号



菌 落 数
W1177 × HfrC 对照








2.重组子的遗传分析


　　多基 培养
菌落数 皿号 EMB


NaN3
发 xyl mal mtl ara lac gal 发 酵 不发 酵 发 酵 不发 酵 发 酵 不发 酵 发 酵 不发 酵 发 酵 不发 酵 发 酵 不
酵 Ⅰ
Ⅱ 重组百分数


3.根据重组百分数，写出这些基因在染色体上的顺序。

实验十七质粒 DNA 的扩增与提取
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链共价闭合的环状 DNA，是染色体以外稳定的遗 传因子。 细菌质粒复制的特性既决定于质粒本身又决定于宿主，它的复制必然受到 双重控制。质粒在细菌细胞内的复制，可分为两种类型：严密型或称严密控 制（stringentcontrol）复制型和松驰型或称松驰控制（relaxedcontrol） 复制型。严密型质粒的复制似乎和染色体的复制受到相同因素的控制即染色 体不复制时质粒也不复制，相对于一个染色体的质粒数不过 1—2 个。松驰型 质粒的复制似乎受不同因素的控制，在整个细胞周期中随时可以复制，即当 染色体复制已经停止，该质粒仍能继续复制，该质粒拷贝数可在 20 个以上。 在使用蛋白质合成抑制剂——氯霉素时，就一般情况来说，染色体 DNA 和
质粒 DNA 的复制会逐渐减慢直至完全停止。但对 ColEl 及类似的质粒却恰好 相反，在达到细胞内没有蛋白质合成，寄主染色体 DNA 的合成会减慢并逐渐

停止的情况下，而 pBR322 质粒 DNA 仍能复制 12—16 小时，直到每个细胞大 约积累近 3000 个拷贝为止。利用这一特性，在培育菌液时加入蛋白质合成抑 制剂——氯霉素，可以扩增大量的质粒，质粒 DNA 含量可达细胞 DNA 总量的
40—50％。
　本实验首先是抽提出细胞总 DNA。提取时在温和条件下用溶菌酶和十二烷 基硫酸钠（SDS）使细菌细胞溶菌裂解，溶菌酶可破坏细胞壁中的糖肽层，阴 离子去污剂 SDS 可使细胞膜崩解，从而达到菌体充分裂解，此时菌液由稀变 稠。细菌染色体 DNA 附在细胞膜碎片上。通过控制菌悬液和碱性 SDS 溶液的 比例，使溶菌液的 pH 为 12—12.5。在此 pH 条件下，染色体 DNA 发生变性，
而 pBR322 分子量较小且有具紧密的超线团结构，不发生变性。加入高浓度的 酸性乙酸钾-乙酸缓冲液中和碱性溶菌液，变性染色体 DNA 凝聚成不溶性絮状 物。SDS 与蛋白质形成复合物也被沉淀下来，SDS 且转变成溶解度较小的十二 烷基硫酸钾，可使沉淀更完全。在上清液中若加入氯仿-异戊醇，使蛋白质去 除更彻底。经乙醇沉淀法得到的 DNA 沉淀中会混有 RNA，再用 RNaseA 处理可 去除 RNA，得到较纯的质粒 DNA 制品。 在进行转化前或检查质粒生物活性之前，常需检定质粒 ccc-DNA 的存在及 纯度鉴定，因完整的双链结构对于转化活性来讲是必要的。在本实验中只采 用平板琼脂糖凝胶电泳法。
二、实验目的
1.学习提取质粒 DNA 的方法，并理解提取原理。
2.用琼脂糖凝胶电泳法初步鉴定质粒 DNA 制品的纯度。 三、实验材料
E.ColiK12（pBR322Apr.Tcr）菌株
四、实验器具和药品
　1.用具：高压消毒锅，水浴摇床或摇床室，离心沉淀器，电热恒温水浴锅， 冰箱，电泳仪（包括平板电泳槽），100 微升、50 微升微量进样器，三角瓶， 离心管，移液管，吸管等。
2.试剂及其配方：
（1）完全培养液（LB 液）（pH7.2—7.4）：称取蛋白胨（或多聚蛋白胨）
10 克，牛肉膏 5 克，氯化钠 5 克。加蒸馏水 800 毫升溶解上述试剂，用
1mol/LNaOH 调 pH7.2—7.4，补加蒸馏水至 1000 毫升。8 磅/英寸 2 灭菌 30
分钟。
　（2）氨基苄基青霉素（ampicillin，简称 Ap）溶液（5 毫克/毫升）：称 取氨基苄基青霉素（医用粉剂）5 毫克，溶于 1 毫升无菌蒸馏水，临用时配 制。
　（3）氯霉素溶液（7.5 毫克/毫升）：称取氯霉素（医用粉剂）7.5 毫克， 溶于 1 毫升 75％乙醇，临用时配制。
（ 4 ） ST 缓 冲 液 （ SucroseTris-HClbuffer ） （ 25 ％ 蔗 糖
50mmol/LpH8.0Tris-HCl）：称取 6.06 克 Tris（三羟甲基氨基甲酸），溶于
800 毫升蒸馏水中，用 1mol/LHCl 调 pH 至 8.0 后，再用蒸馏水定容至 1000 毫克。取该液 75 毫升溶解 25 克蔗糖，即成 ST 缓冲液。冰箱内保存备用。
　（5）溶菌酶液（4 毫克/毫升）：取 0.3 毫升 ST 液和 0.7 毫升蒸馏水于试 管中，加入溶菌酶（生化试剂）4 毫克。临用时配制。
（6）0.4mol/LNaOH（临用时配制）。

（7）2％SDS：称取 SDS（十二烷基硫酸钠）1 克溶于 50 毫升蒸馏水中。
　（8）1％SDS-0.2mol/LNaOH：取 2％SDS 和 0.4mol/LNaOH 按 1∶1（v/v） 混匀，临用时配制。
　（9）3mol/LKAc-2mol/LHAc（pH4.8）：称取醋酸钾 29.4 克，先溶于 80 毫升蒸馏水，加入 11.7 毫升冰醋酸后再补加蒸馏水到 100 毫升。
　（10）氯仿-异戊醇混合液（v/v）：将 24 毫升氨仿（分析纯）与 1 毫升 异戊醇（分析纯）混合均匀，临用前配制。
（11）10×SSC 溶液：称取柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）2.2 克，氯化
钠 4.4 克，定容至 50 毫升蒸馏水。
（12）0.1×SSC 溶液：取 10×SSC 溶液 1 毫升，加蒸馏水至 100 毫升。
　（13）牛胰核糖核酸酶（RNaseA）（用 0.2mol/LpH5.0NaAc 配成 2 毫克/ 毫升）：称取 1.36 克醋酸钠（NaAc·3H2O）溶于 90 毫升蒸馏水中，用 2mol/LHAC 调至 pH5.0 后补加蒸馏水至 100 毫升。称取 RNaseA2 毫克溶于 1 毫升
0.1mol/LNaAc 溶液中。将 RNaseA 液在 100℃中保温 10 分钟。4℃中保存备用。
　（14）0.2％溴酚蓝-1.5％蔗糖溶液：称取溴酚蓝 10 毫克，用蒸馏水溶解， 再加 75 毫克蔗糖，补加蒸馏水至 5 毫升。
（ 15 ）电泳缓冲液 （ 40mmol/LTrib-2mmol/LNaAc-2mmol/LEDTA-Na2 ，
pH8.3）：称取 Tris9.69 克，无水乙酸钠 3.29 克，EDTA-Na21.49 克，溶于
1950 毫升蒸馏水，用浓酸调至 pH8.3，再补加蒸馏水至 2000 毫升。
（16）溴乙（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐，又称菲锭溴红）。
（E.B）原液（0.5 毫克/毫升）：称取溴乙锭（SERVA 产品）5 毫克，溶于 10 毫升电极缓冲液中，置棕色瓶于 4℃冰箱保存备用。临用时用电极缓冲液 200 毫升加 0.6 毫升 E.B 原液（E.B 有毒，不可用口吸，用洗耳球吸）。
（17）0.5％琼脂糖（Agarose）凝胶：称取琼脂糖 0.5 克入三角烧瓶内，
加入 100 毫升电极缓冲液，瓶口上加一小玻璃漏斗。置沸水浴中溶解至透明， 待凝胶冷至 60℃左右制凝胶平板。
五、实验说明
本实验所要提取的质粒 pBR322 是 ColE1 的衍生质粒。在每个细胞内约有
20 多个拷贝，它带有抗氨基苄基青霉素基因（Apr）和抗四环素基因（Tcr），
根据该质粒的抗药性标记，较容易检出和鉴定。
pBR322 质 粒 的 分 子 量 为 2.8 × 106 ， 以 共 价 闭 环 DNA
（covalentlyclosedcircularDNA，简称 cccDNA）的形式存在于细菌细胞质 内。在抽提过程中，一条链发生一处或多处断裂，则另一条自由旋转而使分 子内的扭曲消除形成松散型的分子叫开环 DNA（opencircularDNA，简称 ocDNA），若两条链发生断裂的分子叫线型 DNA（lineDNA，简称 lDNA）。 在质粒 DNA 制品中，可能还会混有染色体 DNA、RNA，以及上述三种类型的 质粒 DNA。而用 pBR322 进行转化时，要求其 DNA 属于 cccDNA。因此需对质粒 cccDNA 的存在进行检定及纯度鉴定，其方法可用琼脂糖凝胶电泳法。 带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳。以琼 脂糖（agarose）凝胶为支持介质的电泳方法已广泛用于核酸的研究中，DNA 分子在高于其等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子 在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应， 与分子大小及分子形态有关。由于带电分子的分子量差异或分子形态的不

同，电泳时呈现迁移位置的差异，如图 17-1。 电泳后用溴乙锭（ethidiumbromide，简称 E.B.）染色。溴乙锭的分子结 构如下：
　它能插入核酸双链区的碱基对之间，形成一种荧光络合物，在 254nm 波长 的紫外光照射下，呈现桔黄的荧光。
六、实验步骤
1.细菌培养与质粒扩增
（1）将 E.coliK12（pBR322Apr、Tcr）菌株从完全培养基斜面上转接一环
在 25 毫升完全培养液内，加氨基苄基青霉素（Ap）0.5 毫升，使 Ap 在培养 液中的终浓度为 100 微克/毫升。37℃振荡培养 12 小时。
　（2）从中取 0.6 毫升种子菌液加入 25 毫升完全培养液中（加入 Ap 的终 浓度仍应为 100 微克/毫克），37℃振荡培养 6 小时。（要求 O.D.600 达 0.6
—0.7）。
（3）加入氯霉素 0.5 毫升（终浓度为 150 微克/毫升）进行质粒扩增。37
℃继续振荡培养 14—16 小时。 注意：以上操作均应在无菌条件下进行和通气培养。
2.溶菌
　（1）取二只离心管，各加扩增后菌液 10 毫升，以 3500 转/分钟，离心 15 分钟，倾去上清液，打散沉淀。
（2）各加入 0.3 毫升溶菌酶液，置 20℃恒温水浴锅中保温 30 分钟。每隔
5 分钟搅动一次。
（3）各加入 0.6 毫升 1％SDS-0.2NNaOH 溶液混匀后置 0℃冰浴 5 分钟。用
0.1 毫升移液管各管取样 0.03 毫升，置微量点滴板孔中，4℃冰箱保存，留 待电泳分析。
3.染色体 DNA 和蛋白质的去除
（1）在上述两管溶菌液中各加入经冰浴预冷的 3mol/LKAc-2mol/LHAc0.45
毫升，充分混匀后于冰浴中静置 10 分钟。3500 转/分钟，离心 15 分钟。用 滴管小心吸取上清液于一支空离心管中即两管上清液合并一管。
（2）加入 1 毫升预冷的经混合均匀的氯仿-异戊醇，在冰浴中不断地轻轻
搅拌 15 分钟。
　（3）3500 转/分钟，离心 15 分钟分相，取上层水相入另一离心管内（抽 提至水相与有机相界面无变性蛋白质为止）。
4.质粒 pBR322DNA 的沉淀
　（1）在所得上清液中加入二倍体积的预冷的无水乙醇，将水与酒精缓缓 搅拌匀，把离心管置于盐冰浴（即冰块内撒上粗盐若干混和）中。
　（2）将离心管连同盛有盐冰的烧杯移置到 4℃冰箱的冰格内（或-20℃冰 箱内），2.5 小时以上，使质粒 DNA 沉淀。
　（3）取出后以 3500 转/分钟离心 15 分钟，倾去上清液，管底可见到白色 沉淀。
　（4）用皱纹纸擦拭离心管内壁上的乙醇，并让乙醇挥发完。 注意：用无水乙醇沉淀质粒 DNA 时，若没有把上清液与乙醇混匀就置冰格 内，由于乙醇在上，水在下，水就会结冰而影响 DNA 沉淀与离心。
5.去除 RNA
（1）在上述沉淀中加入 180 微升 0.1×SSC 溶液，使沉淀溶解，再加 20