微升 10×SSC 溶液。用微量进样器取样 30 微升于微量点样板孔中，留待电泳 分析。
　（2）在余下的溶液中加入 40 微升核糖核酸酶液（RNaseA），于 37℃恒温 水浴锅中保温 1 小时。所得制品置 4℃保存（待转化用）。并取 30 微升于微 量点滴板孔中，留待电泳分析用。
6.质粒 DNA 纯度分析
（1）铺好 0.5％琼脂糖凝胶板。
（2）点样
　将留待电泳分析用的样品按取样顺序依次编为样品 1、2、3、4。在各号样 品中加 6 微升溴酚蓝-蔗糖液，混匀后将各号样品分别全部点加在各个点样孔 内。
　（3）在电泳槽的两极加入电极缓冲液。接通电源，样品端接负极，另一 端接正极。电压梯度为 3—4V/cm，电流强度为 35—40mA，待溴酚蓝移动 4—
5cm（大约电泳 2.5 小时），关闭电源。
　（4）取电极液 200 毫升加入 0.6 毫升 E.B 原液，混匀，将凝胶板浸入 E.B 液中染色 20 分钟。
（5）取出凝胶板置黑色托板上，在紫外层析灯下观察。 七、实验结果
1.记录各实验现象
2.绘出琼脂糖凝胶电泳图谱 正常结果见图 17-2。
（彭文仲、沈大棱）
实验十八大肠杆菌转化实验
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 转化是指一种生物由于接受了另一种生物的遗传物质，从而获得了后者的 某些遗传性状或发生遗传性状改变的现象。
1928 年，F.Griffith 在肺炎双球菌（Diplococcuspneumoniae）中发现了
转化现象后，直到 1944 年转化因子的本质才被 O.T.Avery 等所鉴定，这是说 明遗传物质基础是 DNA 的第一个明确的实验根据。 关于细菌的转化的感受态存在着两种假设，即局部原生质化和酶受体假 设。本实验采用菌株 E.coliK12C600 作为受体。用氯化钙处理受体使其处于 感受态，此时其细胞膜的通透性发生变化，可以促进转化因子 pBR322 的吸 收，但这方面的机制还有待于研究。
　在一定条件下，将质粒 pBR322 与感受态的受体菌共同保温，质粒 DNA 分 子就能进入受体细胞。培养在含有氨基苄基青霉素的完全培养基上，筛选转 化体（transformant）。
　　　　　　　　　　　　　二、实验目的 理解转化的原理和学习用质粒 pBR322 转化大肠杆菌的方法。
三、实验材料

E.coliK12C600


四、实验器具和药品

　1.用具：水浴摇床（或摇床室），离心沉淀器，50 微升微量进样器，三角 瓶，移液管，离心管，培养皿，试管等。
2.试剂与配方

（1）完全培养液（LB 液）（pH7.2—7.4）：称取蛋白胨（或多聚蛋白胨）
10 克，牛肉膏 5 克，氯化钠 5 克。加蒸馏水 800 毫升溶解上述试剂，用
1mol/LNaOH 调 pH7.2—7.4，补加蒸馏水至 1000 毫升。8 磅/英寸 2 灭菌 30
分钟。
（2）完全固体培养基：LB 液+2％琼脂，8 磅/英寸 2 灭菌 30 分钟。
　（3）氨基苄基青霉素（Ap）液（20mg/ml）：称取 Ap（医用粉剂）20 毫 克，加无菌蒸馏水 1 毫升，临用时配制。
（ 4 ） 氯 化 钙 缓 冲 液 （ 0.1mol/LCaCl2 · 2H2O-0.25mol/LKCl-
5mol/LMgCl2·6H2O-5mmol/LTris-HClpH7.6）：称取 Tris（三羟甲基氨基甲
烷）0.03025 克溶解于 40 毫升蒸馏水，用 1mol/LHCl 调至 pH7.6，再将 0.735 克氯化钙，0.931 克氯化钾，0.051 克氯化镁逐一加入使之溶解，补加蒸馏水 定容至 50 毫升。15 磅/英寸 2 灭菌 15 分钟。4℃冰箱保存。
（5）氯化钠缓冲液（0.1mol/LNaCl-5mmol/LMgCl2·6H2O-5mmol/LTris-
HClpH7.6）：称取 Tris0.03025 克溶于 40 毫升蒸馏水，用 1mol/LHCl 调 pH
至 7.6。再将 0.2925 克氯化钠，0.051 克氯化镁逐一加入，使之溶解，用蒸 馏水定容至 50 毫升。15 磅/英寸 2 灭菌 15 分钟，4℃冰箱保存。
（6）1mol/LHCl：取浓盐酸 0.84 毫升，加蒸馏水至 10 毫升。
（7）无菌蒸馏水。
五、实验说明
质粒 pBR322 携带着抗氨基苄基青霉素基因（Apr）和抗四环素基因（Tcr），
而 E.coliK12C600 对 Ap、Tc 是敏感的。把 pBR322 与 C600 混合一定时间后，
pBR322 就能进入感受态的受体菌。带有质粒 pBR322 的受体菌就具有抗 Ap、
Tc 的特性，实现了遗传物质的转移。这种被质粒所转化的受体细胞此时就叫 转化体（transformant）。筛选转化体时，将 pBR322 与 C600 的混合菌培养 在含有 Ap、Tc 的完全培养基平板上。结果只有转化体才能长，pBR322 不能 长，而 C600 由于不抗 Ap、Tc 被杀死。同时以 E.coliC600，pBR322 作对照， 分别涂布在含 Ap、Tc 的完全培养基上，若培养基平板上都不出现菌落，只有 混合菌的培养基平板上生长有菌落，此菌为转化体。其结果表明前一实验所 提取的质粒 pBR322DNA 制品中具有生物活性的质粒 DNA。
其实验过程可概括为图 18-1。
六、实验步骤
1.受体菌培养与处理
　（1）接种一环 E.coliK12C600 于 5 毫升完全培养液中，37℃振荡培养 14 小时。
（2）取 1.5 毫升转接在 25 毫升完全培养液中，37℃振荡培养 2—3 小时。
（3）取二支无菌离心管，各加入 10 毫升培养菌液。3500 转/分钟，离心
15 分钟，倾去上清液，用接种环把沉淀物搅拌匀。
加 5 毫升预冷的氯化钠缓冲液，使两管合并为一管。
（4）3500 转/分钟，离心 15 分钟，倾去上清液，搅匀沉淀。
（5）加入冰浴预冷的氯化钙缓冲液 5 毫升，冰浴保温 25 分钟。
　（6）3500 转/分钟，离心 15 分钟，弃去上清液，搅匀沉淀。加 0.3—0.5 毫升冰浴预冷的氯化钙缓冲液制成感受态的细胞悬浮液。
2.转化

按下表操作：

在冰浴中放置 1 小时以上。以上组别依次称为原始样品液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
3.平板培养
　（1）将上述原始样品液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分别用预冷的氯化钙缓冲液定量到 1.5 毫升，此时依次分别称为样品稀释液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（即均为 10-1）。然后分别 稀释成 10-2、10-3。
（2）涂布平板培养
每 100ml 完全培养基中加入氨基苄基青霉素 0.5 毫升，使其在培养基中的 终浓度为 100 微克/毫升。每一平板接种量均为 0.1 毫升，采用涂布法，操作 见下表所示。


平板 稀释倍数
组别

含 ApLB 培养基 受体菌对照组 Ⅰ 10-1 质粒 DNA 对照组 Ⅱ 10-1 转化实验组 Ⅲ 10-1 ， 10-2 ， 10-3


每一稀释度涂布二皿。37℃培养 24 小时至 48 小时。
注：LB 中若要加 Tc，其 Tc 在 LB 中的终浓度一般为 20 微克/毫升。 七、实验结果
按下表记录结果：

（彭文仲、沈大棱）
实验十九化学诱变物的细菌检测试验（Ames 法）
　　　　　　　　　　　　　　一、实验原理 一些化学物质在哺乳动物体内经过酶的作用转化为终末致癌物，这些活性 致癌物多半能在微生物中诱发突变，因此，一般说来，诱变剂相当于致癌物。 这样，利用从哺乳动物细胞里提取的酶在体外代谢活化化学物质后，如该物 质能诱发细菌突变，或未经代谢活化就能诱发突变者，都可初步认为这种诱 变剂可能是潜在的致癌物。
　　　　　　　　　　　　　二、实验材料 测试菌种：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）组氨酸和生物素
缺陷的突变株（His-，bio-，uvrB，rfa）TA1535，TA1537，TA1538，TA98
和 TA100。其中，TA100 和 TA1535 用来检测诱发碱基置换突变的诱变剂，其 余三枝检测引起移码突变的诱变剂，但也有报告说 TA100 可同时检测两类突 变。


1.配制培养基

三、实验器具和药品

　（1）斜面培养基：牛肉胨 0.5 克，蛋白胨 1 克，NaCl0.5 克，琼脂 2 克， 蒸馏水 100 毫升，pH7.2。高压灭菌，15 磅/英寸 215 分钟。
　
　（2）液体完全培养液：成分同上，不加琼脂，分装成每试管 5 毫升。灭 菌同上。
（3）底层基本培养基：Vogel50×2 毫升，加入葡萄糖 2 克，琼脂 1.5 克，
蒸馏水 98 毫升。高压灭菌 8 磅/英寸 220—31 分钟。
　（4）上层半固体培养基：每 100 毫升培养基中含琼脂 0.7—1 克，NaCl0.5 克，0.5mmol/LL-组氨酸盐酸盐和 D-生物素的混合液 10 毫升。
2.制备 S-9：诱导大鼠肝脏酶系的活性：选成年雄性大鼠 3 只（每只体重
150—200 克），按每公斤体重腹腔注射多氯联苯油溶液 2.5 毫升（多氯联苯 由玉米油配制，浓度为 200 毫克/毫升）。注射后第 4 天起大鼠禁食 12 小时， 然后断头、放血、取肝。肝脏混合称重，用 0.15mol/LKCl 溶液洗涤三次，剪 碎，每克肝（湿重）加 3 毫升 0.15mol/LKCl 溶液，制成匀浆；9，000g 离心
10 分钟，取上清液，分装在小指管里，每管 1—2 毫升。冻存在液氮里或液 氮速冻后贮存在-20℃下（或贮存在-40℃的冰箱中）备用。在取肝以后的操 作过程中，所用的器皿、刀剪、溶液都需保持无菌，并在 0—4℃下进行。
3.制备在使用 S-9 时所离的各种溶液
（1）0.2mol/LpH7.4 磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O7.16 克，KH2PO42.72
克，加水至 100 毫升。高压灭菌 15 磅/英寸 215 分钟。
（2）盐溶液：MgCl28.1 克，KCl12.3 克，加水至 100 毫升，高压灭菌。
　（3）NADP（辅酶Ⅱ）和 G-6-P（葡萄糖-6-磷酸钠盐）使用液：每 100 毫 升使用液中含 NADP297 毫升，G-6-P152 毫克，0.2mol/LpH7.4 磷酸缓冲液 50 毫升，盐溶液 2 毫升，加水至 100 毫升。过滤除菌，经无菌试验后分装，-20
℃贮存。
四、实验说明
　1.菌种鉴定：在实验前需先鉴定测试菌种的一些突变性状是否继续存在， 如菌液中已有部分菌体丧失突变性状，则需作单菌落分离，挑选出保持突变 性状的细菌作为测试菌种。需鉴定的突变性状如下：
（1）组氨酸缺陷突变（His-）：在不含组氨酸的培养基上不生长。
　（2）细菌荚膜脂多糖屏障缺陷突变（rfa）：在接种了细菌的完全培养基 上放一直径为 0.6 厘米的圆形滤纸，滴上 10 微升结晶紫溶液（1 毫克/毫升）。
37℃培养 12—24 小时，在滤纸四周产生一道透亮的抑制圈，表明 rfa 存在，
因为这种突变允许结晶紫这样的大分子进入细菌体内，并抑制其生长。而野 生型细菌的生长不受抑制。
　（3）DNA 切除修复系统缺陷突变（uvrB）：在完全培养基上划线接种野生 型菌种和测试用突变菌，培养皿的半侧用黑纸遮盖，置 15W 紫外灯下 33 厘米 处照射 6 秒钟（TA98 和 TA100 照射 8 秒钟），37℃培养 12—24 小时。突变 菌应在遮光处生长，照光处不生长；野生型菌则在照光和遮光处都生长。
（4）抗氨苄青霉素因子（Apr）：TA98 和 TA100 都带有 pKM101 质粒，上
面有抗氨苄青霉素因子。先在完全培养基上划一道氨苄青霉素溶液（8 毫克/ 毫升 0.02mol/LNaOH），待干后，分别划线接种 TA98、TA100 和野生型细菌， 其方向正好同氨苄青霉素溶液的划线方向相垂直。37℃培养 12—24 小时后， 在氨苄青霉素溶液扩散范围内野生型细菌不长，只有带抗药因子的 TA98 和
TA100 能生长。图 19-1 是菌种鉴定操作简图。
（5）待测菌种的自发回复突变的菌数：每一测试菌株的自发回变菌数应

保持相对稳定。根据国内外一些实验室的报导，各个测试菌株的自发回变数 的变动范围如下：TA98（14—75），TA100（60—220），TA1535（5—30）， TA1537（3—25），TA1538（5—40）。括号中数字是指每皿接种 107—108 细菌中的回复突变数。
　2.诱发阳性指示剂：一般可用 N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG 或 NTG， 用于 TA100 和 TA1535），9-氨基吖啶（9-AA，用于 TA1537），亚硝基（2-NF， 用于 TA98，TA1538）等试剂为实验时的诱变阳性指示剂。另外，加 S-9 试验 时，黄曲霉毒素 B1，需经 S-9 代谢活化后才出现诱变作用，故可用于 S-9 活 性的鉴定。
五、实验步骤
1.细菌培养：从培养在斜面培养基上的测试菌种中挑取少量菌体，接种在
5 毫升完全培养液里，37℃培养 16 小时左右，供诱变试验用。此时细菌数目
在 108—109/毫升。
　2.纸片点样检测：每培养皿（直径为 9 厘米）加底层培养基 15 毫升，冷 却凝固。取 3 毫升上层培养基，加入 0.1 毫升菌液，摇匀后倒入，铺在底层 培养基上。用灭菌的滤纸圆片（直径 6 毫米）蘸待检物的溶液后，置于上层 培养基上，每皿可放 1 到 5 张纸片（待检物如是脂溶性的，可用二甲基亚砜、 乙醇、丙酮等作为溶剂）。37℃培养 48 小时。
3.培养皿掺入检测：每培养皿加底层培养基 15 毫升，待凝。取 3 毫升上
层培养基加 0.1 毫升菌液，再加待检物 0.1 毫升，充分摇匀后倒在底层培养 基上，37℃培养 48 小时。操作程序见图 19-2，但不加 S-9。
4.加 S-9 检测法：操作方法基本上与 2、3 相同，只是在每培养皿的上层
培养基中还需加入 S-9 混合液 0.2 毫升。混合液的配制是把低温贮存的 S-9 置室温下融化，每 2 毫升中加入 10 毫升的 NADP 和 G-6-P 使用液。 混合液置冰浴中，用后多余部分弃去，下次实验时重配。
5.阳性对照和 S-9 活性
　鉴定：每次实验都需作阳性对照（用阳性指示剂代替待检物，以鉴定测试 菌株的有效性），空白对照（包括不加待检物的对照，不加待检物只加 S-9 的对照）。
S-9 的活性也需加以鉴定。黄曲霉毒素 B1 经过 S-9 活化后，如出现诱变作
用，则表明 S-9 有活性。
六、实验结果
　1.诱变性的定性鉴定：用纸片点样检测时，凡在点样纸片周围长出一圈密 集的回变菌落者，该待检物即为诱变阳性物质。反之，如只出现散在的回变 菌落，其数目与对照相近，则记为阴性。培养皿掺入检测法是直接查点培养 基上长出的回变菌落数。凡在背景生长的菌苔上长出的回变菌落数，比对照 组的自发回变菌落数增加一倍以上的，记为阳性反应。
　2.诱变性的定量鉴定：用培养皿掺入检测法时，计算不同浓度的待检物所 诱发的回变菌落数，在一定的浓度范围内，阳性诱变物的浓度同回变菌落数 一般有一线性关系。浓度高到某一程度时，往往出现抑制细菌生长的现象， 从而使回变菌落数下降。因此，可以用这些数据来确定最有效的诱变浓度， 抑菌生长的浓度以及不致诱发突变的所谓“允许浓度”或“安全浓度”。
3.数据记录和分析：培养皿检测试验时，每一待检物浓度一般需至少做三

个培养皿，计算每只培养皿上的菌落数后，求出平均数。一般在平均数后应 注明标准误差，即平均数±标准误差。标准误差（S x ）的计算公式为：
2

∑x2
S ?

( ∑x)
?
n

x n( n ? 1)
x 为每只培养皿计数得到的回变菌落数；n 为所做的培养皿的皿数。 把待检物名称和数据填入表内：
附表
菌株 S-9
浓度（微克/皿） TA98 TA100 TA1535
不加
加
不加
加
不加
加 0 每皿平均回变菌落数
　　　　10 每皿平均回变菌落数
　　　　100 每皿平均回变菌落数



4.注意事项
　（1）上层培养基要放在 45℃水浴中保温，这样琼脂不会凝固；如温度过 高，会烫死细菌和使 S-9 中的酶失活。
（2）培养皿掺入检测试验计算菌落数时，要注意有无背景生长的菌苔，
一般可用低倍显微镜（×40）观察。如无菌苔而出现很多菌落者，应判为“假 阳性”。这是由于待检物杀死了大部分细菌，使残存的少数细菌得以利用培 养基中微量的组氨酸和生物素长成肉眼可见的菌落，但这不是诱发出现的回 变菌落。
（3）测试菌株的斜面传代次数不宜太多，尤其是 TA98 和 TA100，因为经
常传代很容易丢失突变性状，特别是 R 因子（抗氨苄青霉素因子）。另外， 保存菌种时，0.8 毫升新鲜肉汤菌液加 0.07 毫升二甲基亚砜（至少为分析 纯），在-80℃低温下或液氮中冻存。
（4）如果制备 S-9 有困难，可以不用 S-9。但这样的检测试验，无法查出
必须经过酶的代谢活化才会出现诱变作用的诱变剂。 实验二十人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理
外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在 G1 期（或 G0 期），一般情况下是
不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，这种小淋巴细胞受刺激 转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的 处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、 病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
　　　　　　　　　　　　　二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。
三、实验材料

人的外周血淋巴细胞。


四、实验器具和药品

　1.用具：2 毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试 剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微 镜。
　2.器皿的清洗和消毒玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净， 烘干后浸泡在洗液中至少 2 小时，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内，150
℃小时。
隔离衣、口罩、橡皮塞、注射用针筒等则用高温高压消毒（15 磅 15 分钟）。
3.药品
　（1）RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末 10.5 克，用 1000 毫升的 双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或 CO2 气体处理，如
pH 值降至 6.0 时，则可溶解而透明。每 1000 毫升溶液加 NaHCO31.0—1.2 克， 以干冰或 CO2 气体校正 pH 至 7.0—7.2。立即以 5 号或 6 号细菌漏斗过滤灭
菌，分装待用。
（2）肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末 160 毫克（每毫克含 126 单位），
用 40 毫升的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每毫升 500 单位。高压消毒 8
磅 15 分钟。
　（3）秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制 细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素 4 毫克，用
100 毫升生理盐水溶解，用 6 号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱 4℃保存。使用
时用 1 毫升注射器吸取该溶液 0.05—0.1 毫升加入 5 毫升的培养物中，其最 终浓度为 0.4—0.8 微克/毫升。
（4）植物凝血素（PHA）：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取 PHA 的方法
有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品 为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色、黄色、白 色的四季豆亦可。取豆子 20 克，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。 先在水中浸过夜（4℃），次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加 30 毫升生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加 70 毫升生理盐 水，混合均匀。置冰箱 24 小时。然后以 3000 转/分离心 15 分钟，取上清液， 用生理盐水稀释 10 倍，5 号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。 酒精乙醚提取法：四季豆 50 克，先用生理盐水洗净。将豆浸入 60 毫升盐 水中，保存于 4℃冰箱内，24 小时后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加 140 毫升盐水，置 4℃冰箱中 24 小时，取出后以 6000 转/分离心 20 分钟，吸取 上清液，调 pH 至 5.6（用 0.1mol/LHCl 调）之后，每 100 毫升上清液加 40 毫升无水酒精，加以搅拌，以 3000 转/分离心 15 分钟，取上清液，弃去沉淀。 在每 100 毫升上清液中加 170 毫升 10％乙醚无水酒精（10 毫升乙醚+90 毫升 无水酒精）以 3000 转/分离心 15 分钟，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的 抽气干燥器中抽气 2—4 天，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以
0.85％NaCl 液配成 1％的溶液，此 PHA 溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中， 冰冻保存。使用时每 5 毫升培养物加 0.1 毫升即可。如果在得到沉淀物后的

干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的 PHA 溶液便无需用细菌 滤器过滤。
（5）抗菌素
　青霉素（以每瓶 40 万单位为例）：以 4 毫升生理盐水（或培养基）稀释， 则每毫升含 10 万单位。取 1 毫升加入 100 毫升培养基中，则最终浓度为 100 单位/毫升。
　链霉素（以每瓶 50 万单位为例）：以 2 毫升生理盐水（或培养基）稀释， 则每毫升含 25 万单位。取 0.4 毫升（含 10 万单位）加入 1000 毫升培养基中，
则每毫升含 100 单位（即 100 微克）。（100 万单位=1g，1g=1×106μg）。
　（6）姬姆萨染液：0.5 克姬姆萨粉末，加 33 毫升纯甘油，在研缽中研细， 放在 56℃恒温水浴锅中保温 90 分钟，再加入 33 毫升甲醇，充分搅拌，用滤 纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液（pH7.4）
1∶10 稀释。
（7）0.1mol/L 磷酸缓冲液：
pH7.4－7.6
A. Na2HPO4 · 12H2O2 8.8 克
KH2PO4 （无水） 2.67 克
溶解于 1000 毫升双蒸水中。
B. Na2HPO4 · 7H2O 2.164 克 NaH2PO4 · 2H2O 0.3 克 溶解于 1000 毫升双蒸水中。

五、实验步骤
　1.培养液的分装：在无菌室或接种罩内，用移液管将培养液和其它各试剂 分装入培养瓶，每瓶量为：
培养液（ RPMI1640 或 M199 ） 4 毫升
小牛血清 1 毫升
PHA 0.2 毫升 肝素 0.05 毫升
双抗（青霉素加链霉素） 培养液中最终浓度各为
100 单位/毫升



　用 3.5％NaHCO3 调 pH 到 7.2—7.4，分装到 20 毫升的玻瓶中，用橡皮塞塞 紧，待用或置于 0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入 37℃恒温锅中温
育 10 分钟。
　2.采血：用 2 毫升灭菌注射器吸取肝素（500 单位/毫升）0.05 毫升湿润 管壁。用碘酒和酒精消毒皮肤，自肘静脉采血约 0.3 毫升，在酒精灯火焰旁， 自橡皮塞向培养瓶内（内含有生长培养基 5 毫升）接种，轻轻摇动几次，直
立置 37℃±0.5℃恒温箱内培养。
3.培养：置 37℃温箱内培养 66—72 小时。
　4.秋水仙素处理：培养终止前在培养物中加入浓度为 40 微克/毫升的秋水 仙素 0.05—0.1 毫升，最终浓度为 0.4—0.8 微克/毫升，置温箱中处理 2—4
　
小时。
　5.低渗处理：低渗液的种类较多，如 0.075mol/L 的 KCl 溶液，0.95％的 枸橼酸钠溶液，用蒸馏水稀释 4 倍的 Hanks 液，也可直接用蒸馏水。秋水仙 素处理完毕，小心地从温箱取出培养瓶，用滴答吸弃上清液，培养物沉积在 瓶底，然后加入温育的低渗液 5 毫升，用滴管轻轻冲打成细胞悬液，装入离 心管中置 37℃温箱内处理 20 分钟，使红细胞破碎，白细胞膨胀。
6.离心：以每分钟 1000 转，离心 5 分钟，弃去上清液，收集白细胞。
　7.固定：固定液为甲醇：冰醋酸=3∶1。每只离心管中，加入固定液 2—4 毫升，片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定 15 分钟后，离心， 吸弃上清液，留下白细胞。
　8.再固定：加入固定液 2 毫升，用吸管轻轻打散，室温下继续固定 15 分 钟（过夜也可以）。
9.再离心：除去上清液，留下白细胞制片。
　10.制片：向上述离心管中滴入固定液 0.5 毫升，用滴管小心冲打成悬液， 从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片，每片滴加悬液 1—3 滴，用嘴轻轻吹 散，用电吹风吹干，或在酒精灯火焰上微微烤干。
　11.染色：用磷酸缓冲液（pH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20 分钟， 然后倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。
12.镜检：待稍干后，在显维镜下检查。先用低倍镜寻找良好的分裂相，
然后用高倍油镜观察。
　13.封片：用加拿大树胶封片。选择染色体清晰，分散度好的细胞进行显 微摄影，进行核型分析（见图 20-1）。
六、实验注意事项
　1.接种的血样愈新鲜愈好，最好是在采血后 24 小时内进行培养，如果不 能立刻培养，应置于 4℃存放，避免保存时间过久，会影响细胞的活力。
2.在培养中成败的关键，除了至为重要的 PHA 的效价外，培养的温度和培
养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养最适温度为 37±0.5
℃。培养液的最适 pH7.2—7.4。
　3.培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继 续放回 37℃恒温箱内培养。
4.制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一
团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜。 七、实验结果
　1.核型分析：人类每个体细胞有 46 条染色体，22 对常染色体和一对性染 色体，男子是 46，XY；女子是 46，XX（见图 20-2）。求取以下三个参数：
■
（1）染色体的相对长度
单个染色体长度×1000
?
22 条常染色体总长 ? 1条X染色体长度

长臂长度

（2）臂比率 ?

短臂长度


（3）着丝点指数 ?

短臂长度 染色体全长


×100

　可以将人的 46 条染色体分成 A、B、C、D、E、F、G 七群，作为进一步识 别和鉴定染色体的依据。

实验二十一姊妹染色单体色差方法
一、实验原理
　在 DNA 复制过程中，核苷的类似物 5- 溴脱氧尿嘧啶核苷 （ 5- Bromodeoxyuridine 简称 BrdUrd ）或 5-碘尿嘧啶核苷（ 5-Iodo-2′ - deoxyuridine 简称 IdUrd）可以代替核苷酸掺入新合成的 DNA 链，并占有胸 腺嘧啶（Thymidine，T）的位置。哺乳类细胞在含有适当浓度的 BrdUrd 的培 养液中经历二个分裂周期之后，其中期染色体的两个单体的 DNA 双链在化学 组成上就有了差别：即一条染色单体的两股 DNA 的 T 位完全由 BrdUrd 代替， 而另一条染色单体的两股 DNA 中的一股含 BrdUrd，另一股则不含 BrdUrd。这 样的细胞经过制片和苯并咪唑荧光染料（Hoechst-33258）染色后，在荧光显 微镜下可观察到两条姐妹染色单体显示强弱不同的荧光。两股 DNA 链都含有 BrdUrd 的单体荧光较强，其中只有一股有 BrdUrd 的单体荧光较弱。但由于 荧光染料发出的荧光消失较快，只能立刻在荧光显微镜下照相而不能长期保 存。1974 年 Korenberg 和 Freedlender 改进了这一技术，单独用 Giemsa 染 色即获得姐妹染色单体差别染色（sister-chromatiddifferentialstaining
简称 SCD）（图 21-1）。
来自一个染色体的两条单体之间同源片断的互换称为姐妹染色单体互换
（sister-chromalidexchange，简称 SCE）。这种互换是完全的，对称的。 由于姐妹染色单体染色上的明显差异，如果姐妹染色单体间在某些部位发生 互换，则在互换处可见有一界限明显、颜色深浅对称的互换片段，故 SCE 易 于计数，即使在■一定距离内发生多次互换，也可被检测出来。
目前认为 SCE 反映了 DNA 的损伤，可以使用 SCE 作为哺乳类动物突变形成
的指标。由于 SCE 分析方法比观察染色体畸变更简便、迅速、敏感，并表现 出很好的剂量效应关系，因此，目前已将此法列为检测诱变剂或致癌物的常 规指标之一。
二、实验目的
1.了解姊妹染色单体差别染色技术的原理和制作 SCE 标本的方法。
2.通过 SCE 标本的观察，掌握 SCE 计数方法。 三、实验材料

人的外周血。


四、实验器具和药品

　1.用具：2 毫升和 1 毫升灭菌注射器，吸管，移液管，离心管，量筒，烧 杯，无菌青霉素瓶，试剂瓶，培养瓶，酒精灯，载玻片，天平，紫外灯（15W）， 离心机，恒温培养箱，显微镜。
　2.药品配制：RPMI1640，肝素，植物凝血素（PHA），秋水仙素，青、链 霉素，姬姆萨染液等的配制方法见本实验第二十，《人的外周血淋巴细胞培 养》。
　（1）小牛血清：最好经过透析处理。将小牛血清装入透析袋中，用线扎 紧封口，小心检查，切勿有漏孔。然后将透析袋放在盛有双重蒸馏水的玻璃
　
器皿中，每隔 1—2 小时换一次水，搁置在 4℃冰箱中，24 小时后赛氏滤器灭 菌过滤。
（2）3.5％NaHCO3 溶液：称 3.5 克 NaHCO3，用 100 毫升双蒸水溶解，10
磅 15 分钟高压灭菌，调节 pH 用。
　（3）BrdUrd 溶液：用无菌青霉素瓶，在普通条件下用分析天平称取 BrdUrd2 毫克，然后在无菌室内加入灭菌生理盐水 4 毫升，母液的浓度为 0.5 毫克/ 毫升。用黑布避光，置冰箱中保存。最好现配现用。
（4）1mol/LNaH2PO4，pH8.0 的溶液；称取 120 克 NaH2PO4，加入 1000 毫
升双蒸水，用 NaOH 粉末调 pH 至 8.0 即可。
　（5）2×SSC 溶液（0.3mol/L 氯化钠，0.03mol/L 枸橼酸钠，称取 NaCl17.54 克，枸橼酸钠 8.82 克，各用蒸馏水 1000 毫升溶解，使用时两溶液等量混合。
（6）pH 为 6.8 的 mol/L/15 磷酸缓冲液：
甲液：取 KH2PO49.08 克，溶于 1000 毫升蒸馏水中。
乙液：取 Na2HPO2·2H2O11.88 克或 Na2HPO4·12H2O23.87 克，溶于 1000 毫
升蒸馏水中，将 50.8 毫升的甲液与 49.2 毫升乙液混合，即得 pH 为 6.8 的
mol/L/15 磷酸缓冲液。
五、实验步骤
　（一）在无菌条件下，用 20 毫升的青霉素瓶分装 5 毫升培养液，其中 RPMI1640 占 80％；小牛血清占 15—20％；PHA0.2 毫升；青霉素 100 单位/ 毫升；链霉素 100 微克/毫升。最后用 3.5％NaHCO3 调节 pH 至 7.2—7.4。
　（二）每 5 毫升的培养液中加入 BrdUrd0.1 毫升，最终浓度为 10 微克/毫 升。
（三）每瓶培养液中加入 0.3 毫升静脉血，轻轻摇匀，用黑布避光，立即
置 37℃温箱中培养。
　（四）培养 72 小时左右，加入秋水仙素 0.4—0.8 微克/毫升，继续培养 4 小时。
（五）按常规收集细胞，用 0.075mol/LKCl 或蒸馏水低渗 20 分钟，用甲
醇：冰醋酸 3：1 配制的固定液固定两次，每次 15 分钟，用气干法制片，一 天以后将染色体制片放入 70—80℃烤箱中烘烤 1—2 小时，或放在 37℃温箱 中存放备用。
（六）染色体标本的差别染色方法有两种：
1.碱的热溶液处理：将染色体标本浸在 88℃的 1mol/LNaH2PO4（pH 为 8.0）
的溶液中，处理 20 分钟，取出后立即用蒸馏水冲洗，用常规 Giemsa 染色 5 分钟，再用蒸馏水冲洗，干燥，观察。
2.紫外灯照射诱发：染色体标本在 37℃条件下搁置 24 小时后取出，放在
45—48℃的水浴锅上，覆盖一层 2×SSC 溶液（0.3mol/LNaCl，0.03mol/L 枸 橼酸钠），15W 紫外灯照射 20—30 分钟，灯管与载玻片之间距离为 6 厘米（照 光期间防止2×SSC溶液干涸）。照射完毕，用蒸馏水冲去2×SSC，用3％Giemsa
（pH6.8 磷酸缓冲液稀释）染色 5—10 分钟，水洗，气干后镜检。
　（七）在普通光学显微镜下观察，可见姊妹染色单体呈现鲜明的深浅不同 的颜色（见图 21-2）。
■
六、注意事项

　1.在本方法的基础上，如将培养基组成、培养液的酸碱度、培养温度或培 养时间等因素略加变动，可适用于其他一些哺乳动物、鸟类或两栖类动物淋 巴细胞的培养，用以观察它们的姊妹染色单体色差。例如中华大蟾蜍淋巴细 胞培养时，所用的培养基组成除 RPMI1640 外，还补充一定量的水解乳蛋白， 培养基的 pH 为 7.0—7.2，培养温度为 26℃。
　2.BrdUrd 溶液最好现配现用，一次使用不完，必须有黑布避光，4℃冰箱 保存。
3.BrdUrd 在培养开始时加入，或在培养后的 24 小时加入均可。
　4.用紫外灯照射诱发姊妹染色单体互换时，如紫外灯功率大，W 数高，照 射的时间就相应地减少。
　

1.SCE 的计数方法

七、实验结果

凡染色单体端部出现的互换计为一个 SCE，在染色单体中间出现的互换计
为 2 个 SCE；在着丝粒部位发生的互换在判明不是两条染色单体在着丝部位 发生扭转计为一次 SCE。
　2.选细胞轮廓完整，染色体数为整二倍体的中期象进行 SCE 分析。每一样 品，一般选择 30 个细胞进行分析，最后求得一个平均数。
供血者姓名 观察细胞数 每个细胞的 SCE 平均 SCE\细胞


实验二十二活体骨髓细胞姊妹染色单体色差方法
一、实验原理 活体中姊妹染色单体色差方法的原理与离体 SCE 相似。由于活体试验伴随 有体内代谢活化，为了解决 5-溴脱氧尿苷（BrdUrd）或 5-碘脱氧尿苷（IdUrd） 在动物体内迅速降解的问题，要在细胞 DNA 复制的两个细胞周期中，不断补 充外源的核苷类似物，使 DNA 双链的化学组成形成差别，经过分化染色处理， 才能使二条姊妹染色单体呈现深浅不同的色差。
二、实验目的
1.了解活体 SCE 形成原理和方法。
2.通过实验全过程操作，制备出骨髓细胞 SCE 标本。
3.熟悉 SCE 计数方法并对实验结果进行显著性测验。 三、实验材料
6—8 周龄的纯系小鼠，体重为 20 克左右。 四、实验器具和药品
1.用具：手术剪刀（12、16 厘米），镊子（l0、12 厘米），止血钳（8、
12 厘米），手术用针和外科手术用丝线，压制药片的压片机（孔的内径为 0.5 厘米），2 毫升灭菌注射器，吸管，离心管，烧杯（1.5、50 毫升），量筒， 载玻片，试剂瓶，天平，台秤，紫外灯（15W），恒温水浴锅，离心机，显微 镜。另备少许纱布，酒精和碘酒棉球。
2.药品配制
　（1）10％酵母制剂：称取干酵母粉（上海酵母厂）2.5 克，葡萄糖 5.5 克， 加入 25 毫升 40℃的温水。充分混匀，置 40℃温箱中保温 1.5—2 小时，待液
　
体表面有少量气泡出现即可使用。 本实验采用酵母制剂的目的是刺激动物骨髓细胞，可增加有丝分裂中期相 的数目。
　（2）秋水仙素溶液：称 5 毫克的秋水仙素，用 5 毫升生理盐水溶解。使 用时按 4mg/公斤量注射。
（3）0.85％生理盐水：0.85 克 NaCl，溶解在 100 毫升双蒸水中。
（4）0.5％氯化钾：0.5 克 KCl，用 100 毫升双蒸水溶解。
　（5）3％姬姆萨染液：3 克姬姆萨粉末，用 50 毫升纯甘油和 50 毫升甲醇 溶解（配制方法参照血培养试剂一节）。
（6）pH6.8 磷酸缓冲液：参照姊妹染色单体色差方法药品配制一节。
（7）2×SSC 溶液：参照姊妹染色单体色差方法药品配制一节。
（8）5-溴脱氧尿苷（BrdUrd）或 5-碘脱氧尿苷（IdUrd）。 五、实验说明
　1.给药方法：可有三种即：多次注射法、皮下埋植法、活性炭吸附一次注 射法。三种方法都可用 BrdUrd 或 IdUrd，它们对 SCD 的效果相同。本实验对 三种给药方法详细介绍，各实验室可根据具体的条件选择使用。
　（1）多次注射法：供试小鼠腹腔内注射 IdUrd10—15 次，每次 0.2 毫升， 每隔一小时注射一次。总用量约 0.75 克/公斤体重。
（2）皮下埋植法
（a）IdUrd 药片制备：
体重为 20 克的供试小鼠，称取 IdUrd20—30 毫克，以绵白糖作为填充料
（粘合剂），二者比例 1：1。两者混合后放入内径为 0.5 厘米的凹形模子内， 插上内心。外加一压力，使药粉压成片剂，取出内心，将药片取出。
（b）IdUrd 药片的埋植：
　将小鼠腹部向上，在腹中线大腿内侧下凹处用剪刀局部去毛，经碘酒、酒 精消毒后用手术小剪剪一小口（约 0.5 厘米），将药片埋入皮下，缝合伤口。
（3）活性炭吸附 BrdUrd 或 IdUrd 注射法
　（a）活性炭的制备：取 10 克活性炭于玛瑙研钵中研成粉末，在 200 毫升 蒸馏水中悬浮 5 分钟，收集上半部悬浮液，经每分钟 1500 转，离心 15 分钟， 获得更细的活性炭粉末。用 2.5％NaOH，蒸馏水及 2.5％HCl，依次分别洗 5 次，然后再用蒸馏水洗 15—20 次，直至洗出的水 pH 为中性或与洗前的水 pH 相同。离心收集活性炭置于烧杯中，180℃烤干。使用前每毫升 BrdUrd 溶液
（10 毫克/毫升）或 IdUrd 溶液（20 毫克/毫升）加入 100 毫克活性炭，磁力
搅拌 2 小时，使活性炭充分吸附 BrdUrd 或（IdUrd）。如采用的是注射用活 性炭（300—400 目过筛），不需经酸碱处理，直接吸附 BrdUrd 或 IdUrd，效 果也很好。
　（b）腹腔注射：把吸附有 BrdUrd 活性炭悬浮液或 IdUrd 悬浮液 1 毫升注 入腹腔内。
　2.实验动物分组：分对照组，受检药物低剂量组、中剂量组、高剂量组和 阳性对照组。一般化学诱变剂和致癌物，供试动物雌雄各半为宜。 低剂量约为临床剂量的 5 倍，中剂量为 20 倍，高剂量为 100 倍。给药途 径一般采用该药临床给药方法（如注射或灌服等）。用药时间视该药在所检 测的器官中达到最高浓度所需时间而定。
3.阳性药物：作为阳性药物对照，可采用环磷酰胺（cyclo-phosphamide）、

丝裂霉素 C（mitomycinC）或甲基磺酸甲酯（methylmethanesulphonate）。 它们的剂量分别为 10—30 微克/克体重，0.5 微克/克体重，5－10 微克/克体 重。给药方法为腹腔内注射。
　4.待测物质：如采用腹腔内注射，则参照其溶解性质，用生理盐水或易溶 试剂溶解。用量一般以 0.l 毫升/10 克体重为宜。如口服（灌胃）给药，通 常用水，生理盐水，1％甲基纤维素，花生油和玉米油作为液体媒介物。
六、实验步骤
　（一）实验动物选用 6—8 周龄的纯系小鼠，体重 20 克左右。 动物称重后，按不同处理组随机分配，分为五组：对照组，受检药物低剂 量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组。
　（二）给药方法以皮下埋植法为例加以说明：各组动物皮下埋植 IdUrd 药 片（剂量为 0.75 克/公斤体重），同时在背部皮下注入 10％的酵母浸出液 0.2 毫升。阳性对照组动物腹腔内注射甲基磺酸甲酯（剂量为 10 毫克/公斤体 重）。
用药完毕，各组动物放回饲养笼，26 小时后，腹腔注入秋水仙素（剂量为
4mg/公斤体重）处理 2 小时，杀死动物，取下股骨，用纱布将腿骨外的肌肉 剔除干净，浸入盛有生理盐水的烧杯中。
（三）骨髓细胞的制备：用骨钳将大腿骨充分压碎，用生理盐水洗出骨髓
细胞，自然沉降后吸出细胞悬浮液，1000 转/分离心 7 分钟，弃上清液，留 下骨髓细胞。
（四）细胞学技术
　1.用 0.5％KCl 低渗液 7 毫升加入盛有骨髓细胞的离心管中，用吸管缓慢 冲打均匀，放入 37℃温箱低渗 20 分钟，然后取出离心管，以每分钟 1000 转 离心 7 分钟。
2.用甲醇、冰醋酸 3：1 配制的固定液固定细胞，15 分钟后离心，换一次
固定液，在室温中搁置 15 分钟，离心，收集细胞，制备细胞悬浮液。
3.将细胞悬浮液滴在清洁的载玻片上，放在 37℃温箱中过夜。
　（五）后处理：染色体标本平放在 45—48℃恒温水浴锅的平面上，玻片上 滴加一层 2×SSC 溶液，用 15W 紫外灯照射 30 分钟，灯管距离标本约 6 厘米。 然后用磷酸缓冲液慢慢洗去标本上的 2×SSC，用 Giemsa 染色，制成的标本 片即可用来观察姊妹染色单体交换图像（图 22-1）。
■


1.SCE 的计数方法

七、实验结果

　观察时选择细胞轮廓完整，染色体为 2n=40 的色差清晰的中期分裂相计 数。染色单体端部和着丝粒之间的互换计作一个 SCE，染色单体中间的互换 计作二个 SCE。
　
小鼠骨髓细胞 SCE 数据

组 别 供 试 小鼠数 观 察 小鼠数 姊 妹 染 色 单 体 互 换（ SCE ） 总数 平均 范围 t 值 p 值 对照 低剂量组 中剂量组 高剂量组 阳性对照



2.统计学处理
（1）分别算出各组的 SCE 平均值 x 和标准误 S x 。 SCE 平均值：
SCE总数
x ? n为细胞数
n
标准差：


∑?x ? x?
S ?


2 ∑x 2
?

∑x2
?
n

n ? 1
标准误：

S2




∑?x ? x?2

n ? 1

S ? ?
x n


n(n ? 1)


∑x 2 ?
?

∑x2
n ? S

n( n ? 1) n
得出五组 SCE 平均数和标准误 对照组 xA ±S
xA
低剂量组 xB ±S
xB
中剂量组 xC ±S
xC
高剂量组 xD ±S
xD
阳性对照组 xE ±S
xE
（2）t 测验


t ? ?

x A ? x B

2 2

∑(x A ? x A )
n A ( n A ? 1)
x A ? x B
?
S 2 ? S
xB

∑(x ? x )
?
n B (n B ? 1)

　查表求 p 值如 P＞0.05 表明差异不显著，可以认为药物无毒性；p＜0.05 差异显著，可以认为药物有毒性。
　
（吕群）


实验二十三活体精原细胞姊妹染色单体色差方法
一、实验原理

　环境中污染因子的遗传学效应，是通过生殖细胞传递的。所谓生殖细胞是 指从原生殖细胞（primordialgermcells）及其分化的一系列细胞，所以既包 括性原细胞（gonocytes），也包括性母细胞和配子等。当生殖细胞中的 DNA， 受到污染因子的影响而损害后，往往引起基因突变或染色体畸变，结果使后 代个体出现形态变化和功能异常，造成遗传上的危害。
　目前认为 SCE 可以反映 DNA 损伤，所以在小鼠精原细胞有丝分裂的两个周 期，即 54—60 小时中，不断掺入 BrdUrd 或 IdUrd，使其染色体 DNA 在结构 上有了差异，通过分化、染色处理，可以得到染色深浅不同的两条姊妹染色 单体，从而可用来检测药物对生殖细胞的诱变作用。
二、实验目的
1.掌握实验方法并制备出精原细胞 SCE 标本。
　2.通过显微镜观察，选择染色体色差清晰，分散度好的中期相进行显微摄 影。实验组和对照组各一张。
3.记录各组（对照组、用药组、阳性对照组）SCE 数据并进行统计学处理。 三、实验材料
6—8 周龄的纯种雄性小鼠，体重 20—25 克。
四、实验器具和药品
　1.用具：剪刀，镊子，止血钳，手术用针和丝线，内径为 0.5 厘米的压片 机，研缽，培养皿，烧杯，量筒，离心管，吸管，注射器，玻片，试剂瓶等。 台称，分析天平，离心机，恒温箱，恒温水浴锅，紫外灯，显微镜。
2.药品：0.85％氯化钠，1 毫克/毫升的秋水仙素，6—12 微克/毫升胶原
酶，0.4％氯化钾，甲醇，冰醋酸，无 Ca2+和 Mg2+的 Dulbecco’s 缓冲液，0.1
％胰蛋白酶，小牛血清，0.075mol/L 氧化钾，0.3％姬姆萨染液，pH6.8 磷酸 缓冲液等。
五、实验说明
　1.利用国产的胶原酶做低渗前的预处理，使曲精细管结缔组织疏松，生殖 细胞容易脱离生精上皮而悬浮于处理液中，制片后，精原细胞分裂相比未经 胶原酶处理的增加 5—10 倍。
曾用不同的胶原酶浓度（6、12、24、48、96 微克/毫升）和不同处理时间
（10、20、30 分钟）进行过比较，结果表明，6—12 微克/毫升，37℃中处理
20 分钟较为适宜，过高浓度的胶原酶溶液或过长时间的处理，均可能使细胞 受到破坏，反而达不到预期的效果。
　2.压制 IdUrd 时，压力要适当，压力小，药片松散，手术时易破碎；压力 过大，药片太板结，埋植后动物难于吸收。
　3.埋植药片时，用手术小剪刀在实验动物腹部开一小口后，用止血钳剥离 局部区域的腹膜时，要小心谨慎，切勿使腹膜损伤。
　4.用活性炭吸附 BrdUrd 悬液注入法时，发现小鼠睾丸表面均吸附一层活 性炭，表明吸附有 BrdUrd 的活性炭注入体内后，通过腹股沟管进入睾丸的鞘 膜腔，从活性炭缓缓释放出来的 BrdUrd 通过扩散透入睾丸膜，由睾丸动脉吸 收进入睾丸，并在降解之前运转至精原细胞，因而只需注射一次，精原细胞 的染色体即能标记上 BrdUrd。其他远离腹腔的组织如骨髓、腮腺等，要加大
　
BrdUrd 剂量或注射两次，其染色体上才能标记上 BrdUrd。 六、实验步骤
　（一）将成熟的雄性 ICR 小鼠，6—8 周龄，体重 20—25 克，随机分为对 照组、试验物质高、中、低剂量组及阳性对照组。 被试物质的剂量标准（高、中、低三个剂量组）、给药途径，用药时间以 及溶剂等参照活体骨髓细胞 SCD 方法中实验步骤一节。 阳性对照组用药方法亦在活体骨髓细胞 SCD 方法中有详细介绍。
　（二）每组小鼠腹股沟皮下埋植 5-碘脱氧尿苷（IdUrd）片（2 克/公斤体 重）或腹膜内注射吸附有 BrdUrd 的活性炭悬液（BrdUrd10mg/活性炭 100 毫 克/毫升）0.5 毫升。
　IdUrd 药片的制备以及 BrdUrd 的活性炭悬液的处理可参照活体骨髓细胞 SCD 方法。
　（三）供试动物在给 IdUrd 或 BrdUrd 之后 58—60 小时处死，取出睾丸。 处死前 4 小时，腹腔注射秋水仙素（4 毫克/公斤体重）。阳性对照组在给 IdUrd
或 BrdUrd28 小时腹腔注入阳性诱变剂，处理 30—32 小时。
　（四）取出的睾丸，用生理盐水洗去血液、脂肪，剥去外膜、充分剪碎、 悬浮于 4 毫升 6—12 微克/毫升的胶原酶中，用滴管打匀，37℃预处理 15—
20 分钟。即加入等量的 0.4％氯化钾，离心 5 分钟（1000 转/分）弃上清液。
　或将剪碎的睾丸，悬浮于无 Ca 离子和 Mg 离子的 Dulbecco’s 缓冲液中。 离心收集组织碎片，用 0.1％胰蛋白酶 37℃处理 10 分钟。然后加入几滴未灭 活的小牛血清使胰蛋酶失活后，离心收集细胞。
（五）用 0.4％氯化钾溶液低渗 30 分钟，离心弃上清液，加 4 毫升甲醇：
冰醋酸（3：l）固定 5 分钟，用滴管轻轻冲吸，待自然沉降后吸取上层细胞 悬液，重复三次，离心后，按常规气干法制片（见图 23-1）。
■
（六）姊妹染色单体分化染色，方法参照活体骨髓细胞 SCD 法。这里从略。 七、实验结果
1.显微镜观察，记录各组 SCE 数据：
小鼠精原细胞 SCE 数据

组 别 供试 小鼠数 观察 细胞数 姊妹染色单体互换（ SCE ） 总数 平均 t 测验 对 照 低 剂 量 组 中 剂 量 组 高 剂 量 组 阳性对照组



2.t 测验（参阅实验二十一的统计学处理）。
（吕群） 参考文献
实验二十四二倍体细胞株培养
一、实验原理

　把哺乳类动物和人体细胞自机体取出，放在玻璃培养瓶中，选择和控制某 些外界条件，使细胞在离体条件下继续分裂生长。现在体外培养技术，已广 泛应用于生理学、免疫学、病毒学、遗传学等方面，对细胞分化、发育、肿 瘤发生以及染色体研究等领域起着很大的作用。
二、实验材料
鼠胎的肺、肾、肝、皮肤。 三、实验器具和药品
　1.用具：培养瓶（30 毫升），移液管（1 毫升，5 毫升，10 毫升），滴管， 培养皿（100 毫米），小指管（10 毫升），白细胞计数板，直柄虹膜剪、虹 膜镊（直、弯），解剖镊（尖端内面有齿），白内障刀，分离针，动脉钳， 止血钳，白瓷盘，光学显微镜，倒置显微镜，隔水式培养箱，蜡板一块，离 心管。
　2.药品：Hanks 液，Trypsin-EDTA 液，RPMI1640，DMEM0.5％水解乳蛋白， M199，秋水仙素，低渗液，Giemsa，青霉素，链霉素，甲醇，冰酯酸，pH6.8PBS。 四、实验说明和步骤
（一）原代培养：取怀孕 18 天的大白鼠胚胎。
1.用铁棒敲击大白鼠的头致死，四肢钉在蜡板上。
　2.用 70％酒精棉球擦遍腹部，然后用一薄层浸透 70％酒精的棉花覆盖在 腹部。
3.到准备室中剪开腹部表皮，打开胸腔。
4.剪开内皮，取出胚胎，去外膜，把胚胎放在培养皿中。
　5.进入无菌室，用 Hanks 液洗胎鼠数次，再剖开胎鼠胸腹腔，剪取肝、肾、 肺。从胎鼠体表剪取皮肤。
6.所取的组织用 Hanks 液洗 3 次。然后用虹膜剪刀，将组织剪碎成 1—2
毫米大小的块，再用 Hanks 液洗 3 次，加入各种培养液，含有 30％小牛血清
及 200 单位/毫升青霉素，链霉素，pH6.8，洗 2 次。肺组织用 DEME、肾组织
用 0.5％水解乳蛋白，肝组织用 RPHI1640，皮肤组织用 M199。
　7.用滴管将组织块吸入培养瓶中，并均匀分散贴在瓶壁上，组织块块数可 多些，吸去多余的液体。放在 37℃温箱中 2—4h，然后加入培养液 0.5 毫升， 轻轻地使组织块浸入培养液，置 37℃温箱静止培养。隔三天换一次培养液。
8.过 3 天，皮肤组织四周伸展出细胞。过 7 天，肺和肾组织四周伸展出细
胞。14 天后，肝组织四周伸展出细胞。
（二）传代培养
1.待组织块四周的细胞密集、组织块之间细胞铺满瓶壁，吸去培养液，加
入 1 毫升 Trypsin-EDTA 液 pH7.8 洗一次，然后在室温中让细胞浸在 1 毫升 Trypsin-EDTA 液中 1—2 分钟，把瓶子翻过来观察。若细胞呈白色一片，而 且细胞间出现针孔状时，可倒去 Trypsin-EDTA 液，再使细胞在室温中静止 3 分钟，轻轻拍打瓶壁，组织块和细胞很均匀地脱离瓶壁。
　2.加入 4 毫升培养液 pH7，使滴管不离液面进行吹打，使细胞呈均匀的单 细胞，静止片刻，用滴管吸取细胞悬液移入另一只培养瓶，放入 37℃温箱培 养。留下组织块再分散贴在原瓶壁上，继续培养以备后用。
　3.传代细胞一般三天后会在培养瓶壁上铺满，再传代，一瓶分传二瓶，接 着可进行染色体制备。
（三）染色体制备

　1.传代后第二天，在倒置显微镜下观察，细胞之间有空隙，但并不很稀疏， 有许多呈气球状透亮的圆细胞，这时相当于生长对数期。
　2.加秋水仙素，浓度为 2—0.2 微克/毫升，处理 4 小时，中断纺锤丝形成， 从而使细胞停留在分裂中期。
　3.倒去培养液，加入 Trypsin-EDTA 液，操作步骤同细胞传代，待细胞从 培养瓶瓶壁上分离下来。立即加入 8 毫升 0.075mol/LKCl 低渗液，用滴管吹 打细胞使其分散，置 37℃低渗处理 30 分钟。低渗处理使细胞因内外渗透压 不同而膨胀。
　4.低渗后在细胞悬液中加入 0.5—1 毫升固定液（3 份甲醇和 1 份冰醋酸）， 吹打一下，可以防止继续低渗及细胞成团，立即离心 1000 转/分，经 5 分钟。
　5.去上清液，加入 0.3—0.5 毫升固定液，用滴管打散细胞，固定 15 分钟， 如此离心固定重覆二次。
6.去上清液，加入 0.3—0.5 毫升新鲜固定液，制成细胞悬液。
7.气干法制片，用 pH6.8PBS 配制 5％Giemsa 液染色。
　8.显微镜下检查，挑选分散良好，染色清晰的图像摄影，进行核型分析。 也可将片子进行染色体分带染色，以作进一步研究。
（四）细胞冻存：正常离体细胞培养，细胞存活有一定的世代，一般传代
到 30—50 代就老化衰亡。同时为了减轻工作量，防 止细胞变异，可将细胞冻 存起来。
1.冻存细胞的培养方法与传代培养相同。待细胞长成单层，略密些，加入
Trypsin-EDTA1 毫升洗一下，然后在室温中让细胞浸在 1 毫升 Trypsin-EDTA
中 1—2 分钟，在瓶壁上观察到细胞呈白色一片，并有针孔状，立即将消化液 去干净，尽量不留，仍在室温中放置片刻，用手轻轻拍打瓶壁，细胞均匀地 滑下。
2.冻液的配制，60％培养液＋30％小牛血清＋200 单位/毫升的青霉素、链
霉素＋10％二甲基亚砜（DMSO，法国制），细胞成活率达 90％以上，pH7.0。 每小瓶细胞加入 2 毫升冻液，用滴管轻轻吹打细胞，以免很多气泡产生，因 为过多气泡会损害细胞，另外会破坏血清中蛋白质的成分。
3.用滴管将含有细胞的冻液吸入 2 毫升安瓿瓶，每只安瓿瓶放 1.5 毫升细
胞悬液，过多的细胞悬液冻存时会引起安瓿瓶炸裂。用火焰封口，务须封好 瓶口，否则冻存时和复苏时也会发生炸裂现象。
4.将安瓿瓶放在 4℃冻箱中 4 小时。
5.置安瓿瓶于气态氮中 20 分钟，然后立即放入液态氮中。
　6.复苏时将安瓿瓶自液氮中取出，立刻放在 40℃温水中，使其在 1 分钟内 溶解，然后在无菌室中打开安瓿瓶，用滴管吸取细胞悬液放入培养瓶中，然 后加入含有小牛血清的培养液，一只安瓿瓶培养一瓶。第二天细胞贴壁生长， 将含有冻液的培养液换成新鲜培养液。因为二甲基亚砜具有防止细胞受冻损 伤的作用，但在细胞存活培养时，会引起毒害作用，从而导致细胞变异，因 此必须待细胞贴壁生长后及时换液。
五、实验结果 哺乳类和人体机体上各种组织，经过离体细胞培养后可以建立各种类型正 常细胞株，如肝、肾、皮肤、脑等等。经过病毒转化，还可建立淋巴细胞株。 有利于对真核细胞进行发育和分化分析，也有利于对人体遗传疾病的研究， 如利用离体培养细胞，进行酶的研究比在人体中研究酶要方便得多。建立的

细胞株可以运输到世界各地的实验室进行研究。若是病人细胞在体外培养建 立了细胞株冻存起来，即使该病人死亡，也可以对该病的病因进行研究。为 此二倍体细胞培养的技术，对于真核细胞遗传学的研究，有其特殊有用的地 方，特别是为真核生物分子遗传学研究提供了原材料。
六、问题
　1.原代培养过程中，组织块贴壁时 pH 应低一些，待细胞生长密集后 pH 要 相应提高，那是为什么？
2.染色体制备过程中，为什么用甲醇和冰酯酸来固定细胞？ 参考文献
（邱信芳）
实验二十五单细胞克隆的分离
一、实验原理 运用经过自然和人工转化的哺乳动物细胞，采用与微生物相似的途径，进 行单细胞培养和分离，由此建立一个简单、快速、可靠的方法，使单细胞培 养形成克隆群体，以供细胞纯化、突变细胞株的选择、识别和分离，可为细 胞融合提供原始材料。
二、实验材料 中国仓鼠（Chinesehamster）肺细胞 Wg3-h.卵巢细胞 CHO-KI.
三、实验器具和药品
　1.用具：培养瓶（30 毫升），培养皿（35 毫米），移液管（1 毫升，5 毫 升，10 毫升），滴管，倒置显微镜，CO2 培养箱，白细胞计数，玻璃铅笔，
玻璃圆环或铝制圆环。
2.药品：PRHI-1640，F12，小牛血清，青霉素，链霉素，Trypsin-EDTA 液。
四、实验说明和步骤
　1.活化亲本细胞，将亲本细胞用 Trypsin-EDTA 液消化再接种，第二天细 胞生长进入对数期，在倒置显微镜上看到细胞生长旺盛，有许多透亮圆形的 分裂细胞，即可供本实验用。
2.将亲本细胞用 Trypsin-EDTA 液消化使成单细胞分散在培养液中（RPMI
或 F12，含 10％小牛血清及 200 单位/毫升青霉素、链霉素，pH6.8）。
3.计数细胞，要求每毫升 1×102 细胞。
4.接种 1 毫升细胞悬液在 35mm 培养皿中，同时加入 2 毫升培养液。
5.置 37℃CO2 培养箱培养 7—10 天，细胞生长会放出 CO2。若接种细胞数
少，放出 CO2 也少，培养液的 pH 就会升高，超过 6.8 甚至 7.8，不利于细胞
生长，放在 CO2 培养箱中有利于稳定培养液的 pH。
　6.正常细胞生长过程中有接触抑制，细胞不会形成堆叠形，而长期体外培 养的细胞，由于受到病毒感染，培养条件的影响，如营养成分、血清，pH 以 及一些未知的原因，会发生变异，这些变异的细胞株，会失去接触抑制的特 性，而形成堆叠形的细胞克隆。单细胞经过培养后，在培养皿中可以用肉眼 看到一个个大小不等的细胞克隆（见图 26-1，F），然后在倒置显微镜下检 查，用玻璃铅笔将没有细胞混杂的细胞克隆圈出来。
　7.在细胞克隆上，放一个玻璃圆环（用 Cello-胶粘住），在环中注入 Trypsin-EDTA 液 2—3 分钟后，用滴管在环中吹打，吸出 Trypsin-EDTA 细胞 悬液滴入含有 3 毫升培养液的培养皿或培养瓶中。
　
　8.一个克降的细胞数往往会超过几百个，仓鼠细胞生长速率一般是每 12 小时分裂一次，在小培养瓶中细胞本身放出的 CO2 足够调节 pH，所以将细胞 放在 37℃隔水式温箱中，也会很好地贴瓶生长。但生长周期长的细胞如人 体、小鼠细胞还是适宜于培养在 CO2 培养箱中。
　9.细胞生长到一定密度，用 Trypsin-EDTA 液消化，分到 2—3 只培养瓶培 养。
10.染色体检查同二倍体细胞周期的染色体检查。 五、实验结果
　哺乳动物细胞通过分离，稀释接种，培养在适宜于单细胞生长的培养液 中，形成细胞克隆。运用这项技术可以制作细胞成活的曲线，即在接种相同 数量细胞的培养瓶中，加入不同浓度的化学药品，或照以不同剂量的射线， 观察其对细胞损害的程度。由此可以在哺乳类细胞中进行诱变试验及分离突 变细胞。为在真核细胞中进行毒理学和细胞融合提供实验手段及材料。
六、问题
1.为什么要活化亲本细胞？
2.单细胞克隆为什么有大有小？ 参考文献
（邱信芳）
实验二十六染色体分化染色技术
一、实验原理
　自 1956 年 Tjio（庄有兴）和 Levan 确定人类染色体数目为 46 个后，1959 年，在 Denver 染色体命名会议上，把人的 46 个染色体分为 7 个群。但对识 别每一个染色仍有很大困难，尤以 C 组更难区别。1970 年，发现染色体分化 染色，并于 1971 年召开了国际性巴黎会议，为 G、Q、C 和 R 带四种分带技术 建立了命名法。以后又逐步建立了 Giemsa11 分化染色法及染色体脆性位点显 示法。为染色体遗传病诊断、杂种细胞检定、特殊细胞株标记、染色体的识 别等开创了一系列检测方法，大大加速了染色体研究的进展。
二、实验材料
体细胞培养后制备的染色体标本；淋巴细胞培养后制备的染色体标本。 三、实验器具和药品
1.用具：离心管、离心机，天平，37℃隔水式温箱，载玻片，盖玻片，恒
温水浴锅，8W 紫外灯，光学显微镜，标本板，玻璃铅笔，定时钟，染色缸， 直柄虹膜镊，滴管。
2.药品：甲醇，冰醋酸，KCl，pH6.8，PBS，Trypsin，ICN 液，GKN 液，
Giemsa，pH110.05mol/LNa2HPO4，氨甲喋呤（Amethopterin），5-溴脱氧尿
嘧啶核苷（BrdU），5-氟脱氧尿嘧啶核苷（FUdR），M199，RPMI1640，小牛 血清，透析小牛血清，青霉素、链霉素，秋水酰胺（colcemid），Hoechst-
33258。


（一）G 带技术
1.试剂

四、实验说明及步骤

（1）固定液：3 份甲醇，1 份冰醋酸（新鲜配用）。
（2）pH6.8PBS：溶液 A——0.lmol/LNa2HPO4，溶液 B——0.1mol/LNaH2PO4。

pH6.8PBS 为 49.1 毫升 A 液加 50.9 毫升 B 液。
（3）pH7.0ICN 液：NaCl0.80 克、KCl0.02 克。Na2HPO4·12H2O0.30 克、
KH2PO40.02 克、蒸馏水 100 毫升。
（4）pH7.0GKN：葡萄糖 0.10 克、KCl0.04 克、NaCl0.80 克、NaHCO30.035
克、蒸馏水 100 毫升。
（5）0.25％Trypsin 溶液：250 毫克 Trypsin 溶于 100 毫升 ICN 液中。
2.显带步骤
（1）将新制备没有细胞质、染色体分散好的染色体标本以 5％Giemsa 液
（蒸馏水配制）染色 5 分钟，将标本放入蒸馏水中漂洗。这种染过色的标本， 至少可保存一周而不影响显带效果。
　（2）制备 G 带前一天，将染过色的标本用固定液脱色 5 分钟，置 60℃烘 箱中 16—24 小时。
　（3）取烘过的标本置预热到 37℃的 0.25％Trypsin 液中 0.5—1 分钟（处 理时间随气温和标本龄而变动）。立即放入 GKN 液中漂洗 15 秒钟。 近年来的研究表明，染色体标本放到 37℃Trypsin 中是 G 带显示的一种预 处理方式，它可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。Giemsa 染料是噻嗪
-曙红染料，染色首先取决于二个噻嗪分子同 DNA 结合，在此基础上它们结合
一个曙红分子，其次取决于一个有助于染料沉淀物累积的疏水环境。通过 Trypsin 预处理可以使阴性 G 带区的疏水蛋白被除去或使它们的构型变为更 疏水状态。由此可见在 G 显带中抽取的蛋白往往是疏水的，而且主要来自阴
性 G 带区。
　（4）然后用 pH6.8PBS 配制 5％Giemsa 液，染色 10—20 分钟，放入蒸馏 水中漂洗数次，空气干燥。
（5）镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本（见图 26-1，A），在染色
体上若出现清晰的深浅相间的带型，即为可取标本，可供摄像分析。若观察 到染色体变粗并显得毛糙边缘，有时甚至呈糊状，那可能是预处理过度了。
（二）C 带技术
1.试剂
（1）5％Ba（OH）2 水溶液：Ba（OH）25 克，蒸馏水 100 毫升。
（2）2×SSC 液：NaCl1.75 克，柠檬酸三钠 0.082 克，蒸馏水 100 毫升。
2.显带步骤
　（1）取 5—7 天标本龄的染色体标本，选择染色体分散度好，没有细胞质 的标本在 0.2mol/LHCl 中室温下，处理 1 小时，然后水洗。这一程序酸的预 处理是使 DNA 脱嘌呤，但没有 DNA 骨架的断裂。
（2）将标本浸于 50℃的 5％Ba（OH）2 液中，10 秒至几分钟 C 随气温和标
本龄而变动），水洗。碱性处理可能通过产生一个高水平的 DNA 变性，促进 继发的 DNA 溶解。
　（3）在 60℃的 2×SSC 液中处理 1 小时，水洗。2×SSC 温育，使 DNA 骨 架断裂并使断片溶解。
　（4）用 pH6.8PBS 配制 5％Giemsa，染色 10 分钟，水洗，空气干燥。C 显 带的基本特征是从染色体臂选择性地抽取 DNA，而 C 带区 DNA 对抽提有较大 的抗性，从而保留了一部分 DNA，因此可以使用 Giemsa 染料显示出 DNA 的不 同分布。
　
　（5）镜检：在显微镜高倍目镜下检查显带标本（见图 26-1，B），如着丝 粒区域或异染色质部位、次级缢痕部位及 Y 染色体深染，染色体其它部位染 不上色，即为可取标本，若观察到染色体均呈白色，那么，可能是碱处理或
2×SSC 温育过度了。
（三）R 带技术
1.试剂
（ 1 ） pH6.8PBS ：溶液 A —— 1/15mol/LKH2PO4 、溶液 B — —
1/15mol/LNa2HPO4。pH6.8PBS 为 1000 毫升 A 液加 900 毫升 B 液。
（2）Earles 液：溶液 A——NaCl6.80 克、KCl0.40 克、NaH2PO4·H2O0.14
克、蒸馏水 800 毫升。
溶液 B——无水 CaCl20.20 克、MgCl·6H2O0.17 克、蒸馏水 200 毫升。
将溶液 A 倒入溶液 B 中，混合后即可。
（3）Hoechst-33258 原液：Hoechest-332582 毫克，蒸馏水 4 毫升。 Hoechest 工作液：200 毫升 1/15mol/LPBS 加 0.75 毫升原液。
（4）吖啶橙（acridineorange） 配制 pH6.5PBS：
溶液 A——0.07mol/LNa2HPO4·12H2O、溶液 B——0.07mol/LKH2PO4。将 32
毫升 A 液和 68 毫升 B 液混合。
吖啶橙工作液：0.1 克吖啶橙于 100 毫升 0.07mol/LPBS 中。
（5）胸腺嘧啶核苷（Thymidine）：使最终浓度为每毫升为 0.3 毫克。
（6）5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）：使最终浓度为 3×10-5mol/L。
　2.标本制备——细胞同步化培养 人体培养细胞在培养瓶中汇合三分之二时，淋巴细胞培养至 72 小时，加 入胸腺嘧啶核苷，最终浓度为每毫升 0.3 毫克。继续培养 17 小时，用 Hanks 液清洗 2 次，加入新鲜培养液，淋巴细胞换入的培养液中仍需含有 PHA，同 时加入 BrdU，最终浓度为每毫升 10 微克。置 37℃温箱中再培养 5 小时，加 入秋水酰胺，最终浓度为每毫升 0.07 微克，在 37℃中处理 2 小时，常规染 色体制片，镜检时，可看到很多染色体分散的核型，且染色体形态均较细长， 有利于提高显带效果。 细胞同步化是由于过量的胸腺嘧啶核苷会使细胞周期停留在 S 期。经过 17
小时的同步化，解除后大多数细胞都迅速起步完成 S 期，随即进入 G2 期直至
M 期。因此控制秋水酰胺处理时间，可以得到细长染色体，进行高分辨率的 显带分析。
3.显带步骤
　（1）所制标本在 Hoechst 工作液中，浸染 20 分钟或在吖啶橙工作液中浸 染 5 分钟，再用 PBS 冲洗 2 次。
　在同步比培养细胞时，进行 BrdU 处理，使 BrdU 在 DNA 复制时渗入到胸腺 嘧啶的位置，又因 BrdU 是一种淬灭剂，凡有 BrdU 的区域都能使吖啶橙和 Hoechst 荧光染料减弱，这对于显带清晰有帮助。
　（2）标本上铺满 1/15mol/LPBS，放在 45℃铁板上，用 8W 紫外灯，灯距 为 5 厘米，照射 15—20 分钟后，蒸馏水洗 2 次。 紫外光的照射造成邻近胸腺嘧啶形成二聚体，即 TT，这样减少了 AT 间的 氢键，使富于 AT 的 DNATm 值下降，也就是这部分的 DNA 更易变性。
　
　（3）标本在 86℃水浴锅中的 Earles 液中处理 1—2 分钟后，蒸馏水洗 2 次。处理时间和气温及标本龄、光照有关。
　R 显带过程中的热处理是重要的步骤，86℃是适宜的温度，使富于 AT 的 DNA 变性而使富于 GC 的 DNA 保持原状。
（4）用 pH6.8PBS 配制 5％Giemsa 染色 5—10 分钟，水洗，空气干燥。
　（5）在显微镜高倍目镜下检查显带标本（见图 26-1，C），R 带是与 G 带 相反的带型，R 带是富于 GC 碱基对的 DNA，是 S 期早复制的 DNA，而其带间 是富于 AT 碱基对的 DNA，是 S 期晚复制的 DNA。在显微镜下可以看到比 G 带 更明显的带型，另外大部分染色体端部为深染，还有若两条 X 染色体中的一 条为晚复制时，呈淡染。这对于染色体间易位和对 X 染色体失活和晚复制关 系的研究将有独特的功能。若在显微镜下呈现一片淡染，可考虑光照时间和 处理时间两者之比例。
（四）染色体脆性位点显示技术
1.试剂
（1）培养液：93 毫升 mol/L199＋5 毫升透析小牛血清＋1 毫升2mol/LHepes
＋1 毫升 10-5mol/LFUdR＋2×104 单位青霉素、链霉素，pH7.6—7.8。
（2）氨甲喋呤（amethopterin），使最终浓度为 10-7mol/L。
（3）BrdU，使最终浓度达 3×10-5mol/L。
（4）秋水酰胺，最终浓度为每毫升 0.07 微克。
2.标本制备：人体培养细胞在培养瓶中汇合三分之二时，淋巴细胞培养至
72 小时，加入氨甲喋呤，最终浓度为 10-7mol/L，继续进行同步化培养 17 小 时，用 Hanks 液清洗 2 次，加入新鲜培养液，在淋巴细胞换入的培养液中仍 需含有 PHA，但在换入培养液去掉 FUdR，而加入 BrdU，最终浓度达 3×10-5M， 继续培养 5 小时，随即加入秋水酰胺，最终浓度为每毫升 0.07 微克，2 小时 后按常规收细胞，空气干燥制片。
3.显示脆性位点：用 pH6.8PBS 配制 3％Giemsa 染色 10 分钟，水洗，空气
干燥。
　4.镜检：在显微镜高倍目镜下观察 100 个分裂中期有 3—30 个染色体上发 现有脆性位点（见图 26-1，D），主要特征为具有宽度不等的非染色裂隙， 常涉及两个染色单体，此外，可出现无着丝粒片段、缺失以及三相交换体征 象（friradialfigure）。
脆性位点可能是富含胸腺嘧啶的 DNA 节段，因此当脱氧胸苷三磷酸库
（dTTP）耗竭时，可造成这一节段在有丝分裂时不能紧密折叠，甚至出现裂 隙或断裂，表现出镜下可见的脆性位点。如在细胞培养液中去除叶酸和胸腺 嘧啶，或加入二氢叶酸还原抑制剂（如氨甲喋呤）和 5-氟脱氧尿嘧啶核苷
（FUdR）、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU），可使脆性位点细胞表达频率明显 增高，说明脆性位点的产生与 DNA 的这一合成代谢过程受阻有关。此外培养 液的 pH 对提高脆性位点的检出率是非常重要的。因为在不同 pH 条件下，叶 酸具有不同的离子形式，其进入细胞的运转速率也就不同，而胸腺嘧啶的摄 入同样受 pH 的影响，因此在选择适当培养液的同时注意 pH 的影响。
（五）Giemsa11 分化染色技术
1.试剂
　（1）Giemsa 原液制备：1 克 Giemsa 放在圆底试管中，加入 6 毫升 60℃纯 甘油，再加入 60 毫升未加温的纯甘油，用锡纸封口，在室温中振荡 1 小时。
　
将管子移到 60℃水浴中振荡过夜。待稍冷后加入 66 毫升纯乙醇，在室温中 振荡 2—3 小时。将此原液保藏在棕色瓶中。
（2）pH11.3，0.05mol/LPBS：
用 17.5 毫升 1mol/LNaOH 调整 0.05mol/LNa2HPO4 的 pH，使成为 pH11.3。
2.标本制备
　常规制片，细胞悬液滴片时为一般片的 1/3 密度。用乙醇-0.2mol/LHCl 洗 一下标本。
3.显色过程
（l）标本浸在 60℃蒸馏水中 2 小时。
　（2）制备染色液，47 毫升 pH11.3，0.05mol/LPBS＋3 毫升 Giemsa 原液， 混和后用滤纸过滤，在 37℃水浴锅中预温。
　（3）标本浸到 37℃Giemsa 染液中 1—6 分钟、标本龄长时适当延长染色 时间。
（4）镜检：在显微镜高倍目镜下观察，灵长类的染色体呈现淡蓝色（见
图 26-1，E），伴有一些特定的异染色质呈品红色。啮齿类染色体会被染成 品红色。
　G11 显带在某些方面是 C 显带的一个类型，而且灵长类确实显示了异染色 质的一个亚型。
五、实验结果
　通过染色体分化染色，可以在染色体上显示出各种带型及脆性位点，有利 于对染色体遗传病的诊断，尤以 X 染色体长臂末端 2 区 7 带和 2 区 8 带之间 或附近的一个特定脆性位点，它表现了非特异性 X 连续的智力低下，被称为 脆性 X 染色体综合症，可以给于叶酸治疗，这一发现将会使许多不明原因的 智力低下患者得以诊断和治疗。Giemsa11 带又可用于人类细胞和啮齿类细胞 融合后所得杂种细胞的检定。再者染色体分化染色一般公认为是 DNA 与蛋白 质的相互作用，而且显带是一种染料特异现象，为此染色体分化染色不仅是 一个具有巨大价值的实用手段，而且对染色体组成的特定水平也将提供重要 资料。
六、问题
1.在染色体分化染色过程中最关键的一步在那里？
　2.体细胞领域中染色体分化染色除应用于染色体遗传病的诊断，杂种细胞 的鉴定外还可应用于哪些方面？
参考文献
（邱信芳）
实验二十七体细胞融合及选择、监定技术
一、实验原理 体细胞融合现象的发现，改变了原来只可在同一物种成员间进行交配并生 殖的经典遗传学研究方法。体细胞融合可在不同种、不同属，甚至更远的机 体之间进行，因此有可能把远缘种的遗传物质引入特定细胞中，制备出很多 遗传上不同的基因组。现在体细胞融合技术已用于体细胞遗传学的各种实 验，为研究基因和染色体行为提供了丰富的机会。
二、实验材料 中国仓鼠细胞（Chinesehamster）肺细胞 Wg3-h 卵巢细胞 CHO-K1

人体淋巴细胞（lymphocyte） 三、实验器具和药品
　1.用具：培养瓶（30 毫升），移液管，滴管，培养皿（35 毫米），倒置 显微镜，光学显微镜，隔水式温箱，白细胞计数板，玻璃铅笔，圆底离心管， 离心机（4000 转/分），粗天平，8W 紫外灯，水浴锅。
2.药品：RPMI1640，F12，小牛血清，青霉素、链霉素，Trypsin-EDTA 液，
白细胞分离液，融合缓冲液（PFBS），0.15mol/LHepes，HAT 选择培养液，
GKN 缓冲液，聚乙二醇（PEG），仙台病毒（Sendaivirus），Hanks，salineG。 四、实验说明和步骤
（一）试剂
1.培养液：RPMI1640（或 F12）＋10％小牛血清＋200 单位/毫升青霉素、
链霉素，pH7.4。
2.白细胞分离液——tris-ammoniumchloride
（l）0.83％NH4Cl：7.47 克 NH4Cl 溶解于 900 毫升三重蒸馏水中。
（2）tris：2.055 克 tris 溶解于 100 毫升三重蒸馏水中。用浓 HCl 调至
pH7.56。
（3）将（1）液和（2）液混和，用浓 HCl 调至 pH7.2。高压灭菌。
3.病毒制备将病毒原液稀释 10-3 后，取 0.2 毫升，接种在 9 天龄鸡胚中，
34℃培养 48 小时，置 4℃24 小时，收取尿囊液。接着进行血凝试验，检查增 殖后病毒的活力。无菌检验，检查整个接种过程是否染菌。融合效率测定， 这一步骤很重要，有时病毒活力高，但融合效率不一定高。冻存，将经过三 项检验的病毒悬液分装安瓿瓶，冻存于负 80℃或液氮。
4.PEG（mw1000）
配制 50％PEG：称取 1 克 PEG，高压灭菌。待冷至 60℃，加入 1 毫升预温
的 0.15mol/LHepes，用 50％NaOH 调至 pH7.6—7.8。
5.HAT 选择培养液
10-3mol/Lhypoxanthine
1.6×10-4mol/Ltbymidine
4×10-7mol/Laminopterin
10-5mol/Lglycine
称好 H、T、G，加三重蒸馏水搅拌，然后加 A，灭菌过滤。
6.PFBS